Пестицидлар глобаль азык-төлек җитмәү проблемасын хәл итүдә һәм векторлар аша тарала торган кеше авыруларына каршы көрәштә мөһим роль уйный. Ләкин пестицидларга каршы тору проблемасы кискен рәвештә кулланылмаган объектларга юнәлтелгән яңа кушылмаларны ачуны таләп итә. Бөҗәкләрнең вакытлыча рецептор потенциалы (TRPV) каналлары — Наньчжун (Нан) һәм актив булмаган (Иав) — гетерологик каналлар (Нан-Иав) формалаштыра һәм бөҗәкләрдә геотропизм, ишетү һәм проприоцепцияне җайга салучы механосенсор органнарда урнаша ала. Кайбер пестицидлар, мәсәлән, афидопирролидон (АП), билгесез механизмнар аша Нан-Иавка юнәлтелә. АП тишек суыручы бөҗәкләргә (гемиптераннар) каршы нәтиҗәле, җепселләрнең функциясен бозып, туклануны булдырмый. АП бары тик Нанга гына бәйләнә ала, ләкин бары тик Нан-Иав кына агонистлар, шул исәптән эндоген никотинамид (НАМ) белән үзара бәйләнештә була ала, шуның белән канал активлыгын күрсәтә. Нан-Иавның инсектицид объекты буларак потенциалына карамастан, аның канал җыюы, көйләүче бәйләнеш урыннары һәм Ca2+-бәйле көйләү турында аз мәгълүмат бар, бу инсектицидларның алга таба үсешенә комачаулый. Бу тикшеренүдә криоэлектрон микроскопиясе Hemiptera бөҗәкләрендә Nan-Iav структурасын кальмодулин-лигандсыз хәлдә, шулай ук анкирин кабатлау цитоплазматик домены (ARD) чигендә AP һәм NAM белән билгеләү өчен кулланылды. Гаҗәп, без Nan аксымының үзе пентамер барлыкка китерә алуын ачыкладык, ул AP аша ARD үзара бәйләнешләре белән тотрыклылана. Бу тикшеренү инсектицидлар һәм агонистлар һәм Nan-Iav арасындагы молекуляр үзара бәйләнешләрне ачыклый, ARDның канал функциясендә һәм җыюдагы әһәмиятен күрсәтә һәм Ca2+ регуляциясе механизмын өйрәнә.
Климат үзгәреше көчәя барган саен, глобаль азык-төлек куркынычсызлыгының начарлануы XXI гасырның төп проблемаларының берсе булып тора, ул җәмгыять өчен каскадлы нәтиҗәләргә китерә.1,2Бөтендөнья сәламәтлек саклау оешмасының "Дөньяда азык-төлек куркынычсызлыгы һәм туклану торышы 2023" (SOFI) докладында дөнья буенча якынча 2,33 миллиард кеше уртача һәм җитди азык-төлек куркынычсызлыгы җитмәүдән интегә дип фаразлана, бу озак вакытлы проблема.3,4Кызганычка каршы, ел саен корткычлар һәм патогеннар аркасында уңышның якынча 20% тан 30% ка кадәр яки аннан да күбрәк өлеше югала, һәм глобаль җылыну корткычларга каршы торучанлыкны һәм культураларның зарарланучанлыгын арттырыр дип көтелә.4,5,6,7,8Пестицидлар эшләү культураларны корткычлардан саклау һәм вектор аша күчә торган патогеннар таралуын киметү өчен генә түгел, ә шулай ук вектор аша күчә торган кеше авыруларына, мәсәлән, денге бизгәге, малярия һәм Шагас авыруына каршы көрәшү өчен дә бик мөһим, чөнки алар пестицидларга көннән-көн чыдамрак була бара.5,9,10,11
Нейротоксик инсектицидларның төп максатлары арасында, гетеротетрамерлы TRPV каналы Nanchung (Nan)-Актив булмаган (Iav) соңгы дистә елда гына ачылган инсектицидлар классын күрсәтә, шул исәптән имидаклоприд һәм пираклостробин кебек коммерция максатларында кулланыла торган инсектицидлар.12,13,14Ярымсинтетик афидопирролифен (AP) инсектициды - күптән түгел эшләнгән һәм коммерцияләштерелгән продукт, аның төп компоненты - актив инсектицид Inscalis®, ул AP белән субнаномоляр активлык дәрәҗәсендә бәйләнә.15AP серкәләндерүчеләргә, файдалы бөҗәкләргә һәм башка максатчан булмаган организмнарга түбән токсиклык күрсәтә, һәм этикеткадагы күрсәтмәләргә туры китереп кулланылганда, ул башка инсектицидларга каршы торучанлык басымын киметергә мөмкин.16,17,18Nan һәм Iav бөҗәк төрләре арасында киң таралган, антенналарның һәм аяк-кулларның хордаль сузылу рецептор нейроннарында гына бергә экспрессияләнә, һәм ишетү, гравитацияне кабул итү һәм проприоцепция өчен бик мөһим.13,16,19,20,21,22АП, имидаклоприд һәм пираклостробин Nan-Iav комплексын уникаль механизм аша стимуллаштыра, нәтиҗәдә проприоцептив сигнал трансдукциясен тоткарлый.13,16,23Битләр һәм ак чебеннәр кебек тишеп суыручы бөҗәкләрдә (гемиптераннарда) проприоцепцияне югалту аларның туклану сәләтен начарайта, нәтиҗәдә үлемгә китерә.13,24Кызыклысы шунда ки, AP Nan-Iav комплексына югары бәйләнеш күрсәтә, ә Nanга гына түбән бәйләнеш күрсәтә. AP-ның Nan-Iav белән бәйләнеше электр тогын китереп чыгара, ләкин Nan белән генә бәйләнеш канал активлыгын стимуллаштырмый. Iav үзе AP белән бөтенләй бәйләнештә түгел.16Бу Nan һәм Iav төрле Nan-Iav канал комплексларын барлыкка китерү өчен бәйләнешкә керә алуын күрсәтә (мәсәлән, төрле стехиометрик нисбәтләрдә яки бер үк стехиометрик нисбәт эчендә төрле тәртиптә) яки AP берничә урынга бәйләнешкә керә ала. Моннан тыш, табигый никотинамид агонисты (NAM) Drosophila Nan-Iav белән микромоляр аффинитет белән бәйләнешкә керә, in vitro битлардагы (AP) эффектларга охшаш эффектлар күрсәтә.16,25һәм битләрнең үрчүен һәм туклануын тоткарлый, нәтиҗәдә аларның үлеменә китерә25,26Бу мәгълүматлар күп сораулар тудыра. Мәсәлән, Nan-Iav гетеродимери ничек барлыкка килүе, кечкенә молекулаларны модуляцияләү өчен нинди бәйләнеш урыннары кулланылуы һәм бу кечкенә молекулаларның проприоцепцияне бастыру юлы белән канал функциясен ничек көйләве ачык түгел. Моннан тыш, Nan үзе ни өчен актив түгел һәм AP өчен түбән аффинитетка ия, ә Nan-Iav гетеродимери актив һәм AP белән югарырак аффинитет белән бәйләнгән сәбәпләре ачык түгел. Ниһаять, Nan-Iav функциясенең Ca2+-бәйле регуляциясе һәм аның нейрон сигнал процессларына ничек интеграцияләнүе турында аз мәгълүмат бар.13,21
Бу тикшеренүдә, криоэлектрон микроскопиясен, электрофизиологияне һәм радиолиганд бәйләү ысулларын берләштереп, без Nan-Iav җыелмасын һәм аның кечкенә молекула регуляторларына бәйләнеш механизмын ачыкладык. Моннан тыш, без Iav һәм AP белән стабилизацияләнгән Nan пентамерларына конститутив рәвештә бәйләнгән кальмодулинны (CaM) ачыкладык. Бу нәтиҗәләр каналлардагы кальций ионнарын көйләү, канал җыелмасы һәм лиганд бәйләү аффинитетын билгеләүче факторлар турында мөһим мәгълүмат бирә. Иң мөһиме, без ARD бу процессларда үзәк роль уйный икәнен расладык. Тиешле авыл хуҗалыгы пестицидларына бәйләнгән тулы бөҗәк каналларын өйрәнү.27, 28, 29пестицидлар сәнәгатен үстерү өчен перспективалар ача, пестицидларның нәтиҗәлелеген һәм спецификасын яхшырта, һәм глобаль азык-төлек куркынычсызлыгы һәм векторлар аша тарала торган авырулар таралу проблемаларын хәл итү өчен башка төрләргә TRPV-ны максат итеп куйган кушылмаларны куллану мөмкинлеген бирә.
Шулай ук без Nan-Iavның Ca2+ белән көйләнүен һәм көйләү механизмының конститутив рәвештә бәйләнгән CaM белән җайга салынуын ачыкладык. Мөһим, CaM белән Navның бу Ca2+ белән бәйле көйләнеше башка ион каналларының көйләү механизмнарыннан сизелерлек аерылып тора (мәсәлән, көчәнеш белән идарә ителә торган Na+ каналлары һәм TRPV5/6 каналлары).52,53,54,55,56,57Nav1.2 каналында CaM-ның С-терминаль домены С-терминаль домен (CTD) белән спираль рәвешендә бәйләнә, һәм Ca2+ үзенең N-терминаль доменын CTD-ның дисталь өлешенә бәйләүгә китерә.56TRPV5/6 каналында CaM-ның С-терминаль домены CTH белән бәйләнә, һәм Ca2+ үзенең N-терминаль доменын өскә таба сузуга китерә, шуның белән катион үткәрүчәнлеген блоклый.53,54Без Nan-Iav-CaM-ның Ca2+ белән көйләнгән функциясе өчен модель тәкъдим итәбез (4h рәсем). Бу модельдә CaM-ның N-терминаль домены Iav-ның C-терминаль доменына (CTH) конститутив рәвештә бәйләнә. Тыныч хәлдә (түбән [Ca2+] концентрациясе), CaM-ның C-терминаль домены Nan белән үзара бәйләнештә була, ARD конформациясен тотрыклыландыра һәм шуның белән канал ачылуын стимуллаштыра. Агонист/инсектицидның каналга бәйләнүе тишекләр ачылуын стимуллаштыра, бу Ca2+ агымына китерә. Аннары Ca2+ CaM-га бәйләнә, Nan-ның ARD-ыннан C-терминаль доменның диссоциациясенә китерә. CaM бәйләнешен блоклау Ca2+-ның ингибитор эффектын юкка чыгарганлыктан, бу диссоциация ARD мобильлеген модуляцияли, шуның белән Ca2+-бәйле ингибирлауга яки десенсибилизациягә китерә. Кальций ионнарын элюцияләгәннән соң канал токларының тиз торгызылуы (4g рәсем) бу механизмның Ca2+ аша нейрон сигналларына тиз җавап бирүен күрсәтә. Моннан тыш, Iavның С-терминаль өлкәсе, әлегә кадәр аз аңлашылган, каналларны максатчан билгеләүдә һәм хәзерге көйләүдә башка рольләр уйный дип хәбәр ителә.21
Ниһаять, безнең тикшеренү авыл хуҗалыгы әһәмиятенә ия булган инсектицид-инсектицид TRP канал комплексының югары сыйфатлы структурасын тәкъдим итә - бу ачыш безгә элек билгеле булмаган. Шунысы игътибарга лаек, без бөҗәк күзәнәкләрендә түгел, ә кеше күзәнәкләрендәге (HEK293S GnTi–) бөҗәк каналының структурасын һәм функциясен характерладык. Инсектицидларга каршы торучанлык арту һәм азык-төлек куркынычсызлыгы һәм патогеннарга даими басым булу сәбәпле, безнең эш кеше сәламәтлеге һәм глобаль азык-төлек куркынычсызлыгы файдасына яңа инсектицидлар эшләүгә ярдәм итәчәк мөһим мәгълүмат бирә. Тикшеренүләр күрсәткәнчә, AP кебек инсектицидлар этикеткадагы күрсәтмәләр буенча кулланылганда кайбер корткычларга каршы нәтиҗәле һәм файдалы серкәләндерүчеләр өчен түбән кискен токсиклыкка ия, бу аларның экологик куркынычсызлыгын күрсәтә.13,16Моннан тыш, кайбер AP деривативларын чебеннәрдә сынап карау аларның ахыр чиктә очу сәләтен югалтуын күрсәтте. Бу модуляцияләүче кушылмаларның Nan-Iav белән ничек бәйләнешен аңлау гамәлдәге кушылмаларны модификацияләүгә яки яңа кушылмаларны эшләүгә ярдәм итәчәк, бу аларны нәтиҗәлерәк һәм нәтиҗәлерәк итәр.төгәлкорткычларга каршы көрәш. Безнең тикшеренү Nan-Iav ARD интерфейсының эндоген кушылмаларның, пестицидларның һәм Ca2+-CaM активлыгын көйләү өчен генә түгел, ә канал җыю өчен дә мөһим булуын күрсәтә. Без кечкенә молекулалар белән гетеродимер җыюны бозу ион канал ингибиторларын эшләү өчен уникаль һәм өметле ысул булырга мөмкин дип фаразлыйбыз.
Сигез ортологик ген арасыннан көрән коңгызның (Halyomorpha halys) тулы озынлыктагы геннары Nanchung һәм Inactive сайланды, алар югыч матдәләрдә бик яхшы тотрыклылык күрсәттеләр. Синтезланган геннар кеше экспрессиясе өчен кодон буенча оптимальләштерелде һәм XhoI һәм EcoRI рестрикция сайтлары ярдәмендә pBacMam pCMV-DEST векторына (Life Technologies) клонлаштырылды. Бу клоннарның HRC-3C протеазасы (PPX) белән киселгән C-терминалы GFP-FLAG-10xHis һәм mCherry-FLAG-10xHis теглары белән рамкада булуын тәэмин итте, бу мөстәкыйль рәвештәгыйбарәpBacMam векторына Nanchung һәм Inactive клонлаштыру өчен кулланылган праймерлар түбәндәгечә иде:
Аерым кисәкчәләрнең микроскопик сурәтләре K3 камерасы һәм Gatan BioQuantum энергия фильтры белән җиһазландырылган Titan Krios G2 трансмиссия электрон микроскобында (FEI) алынган. Микроскоп 300 кэВ көчәнештә, энергия көйләүләре 20 эВ, үрнәк пиксель зурлыгы 1,08 Å/пиксель (номиналь зурайту 81,000x) һәм дефокус градиенты -0,8 дән -2,2 мкм га кадәр булган хәлдә эшләде. Видеоязма секундына 40 кадр тизлегендә номиналь доза тизлеге 25 e–px−1 s−1, экспозиция вакыты 2,4 с һәм гомуми дозасы якынча 60 e–Å−2 булган Latitude S микроскобы (Gatan) ярдәмендә башкарылды.
RELION 4.061 программасында MotionCor2 кулланып, пленкада нур белән индукцияләнгән хәрәкәтне төзәтү һәм дозаны авырлаштыру башкарылды. Контраст күчерү функциясе (CTF) параметрларын бәяләү cryoSPARC программасында патч нигезендәге CTF бәяләү ысулын кулланып башкарылды62. CTF урнаштыру чишелеше ≥4 Å булган фотомикрографлар аннан соңгы анализдан чыгарылды. Гадәттә, cryoSPARC программасында нокта сайлау өчен 500–1000 фотомикрографның бер өлеше кулланылды, аннары шаблон нигезендәге кисәкчәләрне сайлау өчен ачык белешмә рәсем алу өчен фильтрлаудан соң 2D классификациясенең берничә этабы үткәрелде. Аннары кисәкчәләр 64 пиксельле чикләү тартмалары һәм 4 катлы биннинг ярдәмендә алынды. Кирәкмәгән кисәкчә категорияләрен бетерү өчен 2D классификациясенең берничә этабы үткәрелде. Башлангыч 3D моделе ab initio реконструкциясе ярдәмендә торгызылды һәм cryoSPARC программасында тигез булмаган камилләштерү ярдәмендә камилләштерелде. 3D классификация cryoSPARC яки RELION программасында ARD гетерогенлыгына нигезләнеп башкарылды. Мембрана доменнарының әһәмиятле гетерогенлыгы күзәтелмәде. Кисәкчәләр C1 һәм C2 ысуллары ярдәмендә эшкәртелде; югарырак C2 чишелешле кисәкчәләр C2гә карата симметрик дип саналды һәм Байес чишелеше өчен RELIONга импортланды. Аннары кисәкчәләр соңгы тигез булмаган һәм җирле чишелеш өчен криоSPARCка кире күчерелде. Соңгы чишелеш һәм кисәкчәләр саны 1 нче таблицада күрсәтелгән.
Nan+AP пентамерларын эшкәрткәндә, без мембрана доменнарының (бигрәк тә мәсамә өлкәсенең) чишелешен яхшырту өчен төрле ысулларны өйрәндек, мәсәлән, сигналны алу һәм TMD маскировкасы. Ләкин, мәсамә өлкәсендәге потенциаль экстремаль тәртипсезлек һәм TMDның гомуми гетерогенлыгы аркасында бу омтылышлар уңышсыз тәмамланды. Соңгы чишелеш, нигездә, ARD өлкәсенә юнәлтелгән, cryoSPARC'та тигез булмаган эшкәртү ысулы белән автоматик рәвештә булдырылган битлек ярдәмендә исәпләнде. Бу мембрана доменнарының (бигрәк тә VSLD өлкәсенең) чишелешенә караганда күпкә югарырак чишелешкә иреште.
Нанчунг һәм Инактив бөҗәкләрнең апо формаларының башлангыч de novo модельләре башта Coot63 ярдәмендә булдырылды, ә Нан һәм Иав бөҗәкләре модельләре түбән ышанычлы өлкәләрне билгеләү өчен AlphaFold264 ярдәмендә булдырылды. Кальмодулин модельләштерү PDB 4JPZ56 һәм 1CFD65 үрнәкләрендә Ca2+-бәйләнешле һәм Ca2+-сыз модельләрнең каты гәүдәгә туры килүләренә нигезләнгән. Модельләр дөрес стереохимия һәм яхшы геометрияне тәэмин итү өчен сферик камилләштерү ярдәмендә камилләштерелде. Аннары фосфатидилхолин, фосфатидилетаноламин һәм фосфатидилсерин төгәл билгеләнгән липид тыгызлыгы буларак модельләштерелде, һәм NAM һәм AP лигандлары тыгыз тоташуларда тиешле тыгызлыкларга урнаштырылды. PHENIX66'дагы eLBOW кулланып, изоформаларның SMILES чылбырыннан чикләү файллары булдырылды. Ниһаять, модельләр PHENIX'та реаль киңлектә локаль челтәр эзләү һәм икенчел структура чикләүләре белән глобаль минимализация ярдәмендә камилләштерелде. Модельне камилләштерү һәм структураль анализ өчен MolProbity серверы кулланылды, ә иллюстрацияләр PyMOL һәм UCSF Chimera X кулланып башкарылды. 67,68,69 Диафрагма анализы HOLE серверы ярдәмендә башкарылды,70 һәм эзлеклелекне саклау картасы Consurf серверы ярдәмендә башкарылды.71
Статистик анализ Igor Pro 6.2, Excel Office 365 һәм GraphPad Prism 7.0 кулланып үткәрелде. Барлык санлы мәгълүматлар уртача ± стандарт хата (SEM) буларак күрсәтелә. Ике төркемне чагыштыру өчен Стьюдентның t-тест (ике яклы, парсыз) кулланылды. Берничә төркемне чагыштыру өчен бер яклы дисперсия анализы (ANOVA), аннан соң Даннеттның пост-хок тесты кулланылды. *P< 0.05, **P< 0.01, һәм ***P< 0,001 мәгълүматлар бүленешенә карап статистик яктан әһәмиятле дип саналды. Kd, Ki кыйммәтләре һәм аларның асимметрик 95% ышаныч интерваллары GraphPad Prism 10 кулланып исәпләнде.
Тикшеренү методикасы турында тулырак мәгълүмат алу өчен, зинһар, бу мәкаләдә сылтама бирелгән Табигать портфолиосы отчетының кыскача эчтәлеген карагыз.
Башлангыч модель PDB 4JPZ һәм 1CFD мәгълүмат базаларыннан кальмодулин модельләрен кулланып төзелгән. Координаталар Аксым мәгълүматлары банкына (PDB) 9NVN (лигандсыз Nan-Iav-CaM), 9NVO (никотинамид белән бәйләнгән Nan-Iav-CaM), 9NVP (никотинамид һәм EDTA белән бәйләнгән Nan-Iav-CaM), 9NVQ (афенидолпирроллин һәм кальций белән бәйләнгән Nan-Iav-CaM), 9NVR (афенидолпирроллин һәм EDTA белән бәйләнгән Nan-Iav-CaM) һәм 9NVS (афенидолпирроллин белән бәйләнгән Nan пентамер) номерлары астында күчерелгән. Тиешле криоэлектрон микроскопия рәсемнәре Электрон микроскопия мәгълүматлар базасына (EMDB) түбәндәге керү номерлары астында урнаштырыла: EMD-49844 (лигандсыз Nan-Iav-CaM), EMD-49845 (никотинамидлы Nan-Iav-CaM комплексы), EMD-49846 (никотинамид һәм EDTAлы Nan-Iav-CaM комплексы), EMD-49847 (афидопирроллин һәм кальцийлы Nan-Iav-CaM комплексы), EMD-49848 (афидопирроллин һәм EDTAлы Nan-Iav-CaM комплексы) һәм EMD-49849 (афидопирроллинлы Nan пентамер комплексы). Функциональ анализ өчен чимал мәгълүматлар бу мәкаләдә тәкъдим ителә.
Бастырып чыгару вакыты: 2026 елның 28 гыйнвары