Антигельминтик препарат N,N-диэтил-м-толуамид (DEET) AChE (ацетилхолинэстераза) ингибирлавы турында хәбәр ителгән һәм артык кан тамырлары барлыкка килү сәбәпле канцероген үзлекләргә ия. Бу мәкаләдә без DEETның ангиогенезны стимуллаштыручы эндотелий күзәнәкләрен махсус стимуллаштыруын, шуның белән шеш үсешен арттыруын күрсәтәбез. DEET ангиогенезга китерә торган күзәнәк процессларын активлаштыра, шул исәптән пролиферация, миграция һәм адгезия. Бу эндотелий күзәнәкләрендә NO җитештерү һәм VEGF экспрессиясенең артуы белән бәйле. M3 ны тындыру яки фармакологик M3 ингибиторларын куллану бу эффектларның барысын да юкка чыгарды, бу DEET тарафыннан индукцияләнгән ангиогенезның M3-кә сизгер булуын күрсәтә. Эндотелий һәм HEK күзәнәкләрендә M3 рецепторларын артык экспрессияләүче кальций сигнализациясен үз эченә алган экспериментлар, шулай ук бәйләү һәм доклаштыру тикшеренүләре DEETның M3 рецепторларының аллостерик модуляторы булып эшләвен күрсәтә. Моннан тыш, DEET AChE-ны ингибирлый, шуның белән ацетилхолинның биокулланылышын һәм аның M3 рецепторларына бәйләнешен арттыра һәм аллостерик көйләү аша проангиоген эффектларны көчәйтә.
Беренчел ЭКлар Швейцария тычканнарының аортасыннан аерылган. Экстракция ысулы Кобаяши протоколыннан алынган 26. Тычкан ЭКлары дүртенче үтүгә кадәр 5% җылылык белән инактивлаштырылган FBS белән тулыландырылган EBM-2 мохитендә үстерелгән.
HUVEC, U87MG яки BF16F10 пролиферациясенә ике концентрациядәге DEET йогынтысы CyQUANT күзәнәк пролиферациясе анализы комплекты (Molecular Probes, C7026) ярдәмендә анализланды. Кыскасы, һәр коега 5,103 күзәнәк 96 коелы пластинага чәчелде, төнлә беркетелде, аннары 24 сәгать дәвамында DEET белән эшкәртелде. Үсеш мохитен алганнан соң, микропластинаның һәр коесына буяу бәйләү эремәсе өстәгез һәм күзәнәкләрне 37 °C температурада 30 минут инкубацияләгез. Флуоресценция дәрәҗәләре 485 нм кузгату фильтрлары һәм 530 нм эмиссия фильтрлары белән җиһазландырылган Mithras LB940 күп режимлы микропластина укучысы (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Германия) ярдәмендә билгеләнде.
HUVEC 96 коелы пластиналарга һәр коега 104 күзәнәк тыгызлыгында чәчелде. Күзәнәкләр 24 сәгать дәвамында DEET белән эшкәртелде. Күзәнәкнең яшәүчәнлеге колориметрик MTT анализы (Sigma-Aldrich, M5655) ярдәмендә бәяләнде. Оптик тыгызлык күрсәткечләре күп режимлы микропластиналы уку җайланмасында (Mithras LB940) 570 нм дулкын озынлыгында алынды.
DEET йогынтысы in vitro ангиогенез анализлары ярдәмендә өйрәнелде. 10-8 M яки 10-5 M DEET белән дәвалау HUVECларда капилляр озынлыгы формалашуын арттырды (1a, b рәсемнәр, ак сызыклар). Контроль төркем белән чагыштырганда, 10-14 дән 10-5 M га кадәр DEET концентрацияләре белән дәвалау капилляр озынлыгының 10-8 M DEETта платога җиткәнен күрсәтте (Өстәмә S2 рәсем). 10-8 M һәм 10-5 M концентрация диапазонында DEET белән дәваланган HUVECларның in vitro проангиоген эффектында әһәмиятле аерма табылмады.
DEETның неоваскуляризациягә йогынтысын билгеләү өчен, без in vivo неоваскуляризация тикшеренүләре үткәрдек. 14 көннән соң, 10-8 M яки 10-5 M DEET белән алдан культураланган эндотелиаль күзәнәкләр кертелгән тычканнарда гемоглобин күләменең сизелерлек артуы күзәтелде (1c рәсем, ак сызыклар).
Моннан тыш, DEET белән индукцияләнгән неоваскуляризация U87MG ксенотрансплантатлы тычканнарда өйрәнелде, аларга көн саен (ip) DEET белән 10-5 М плазма концентрациясен китереп чыгаруы билгеле булган дозада кертелде, бу 23 елда тәэсир иткән кешеләрдә нормаль күренеш. Ачыкланырга мөмкин булган шешләр (ягъни >100 мм3 шешләр) тычканнарга U87MG күзәнәкләрен керткәннән соң 14 көн үткәч күзәтелде. 28 нче көнне DEET белән дәваланган тычканнарда шеш үсеше контроль тычканнар белән чагыштырганда сизелерлек артты (1d рәсем, квадратлар). Моннан тыш, шешләрнең CD31 белән буялуы DEET капилляр мәйданын сизелерлек арттырганын, ләкин микротамырлар тыгызлыгын арттырмаганын күрсәтте (1e–g рәсем).
Мускарин рецепторларының DETA белән индукцияләнгән пролиферациядәге ролен билгеләү өчен, pFHHSiD (10-7 M, сайлап алынган M3 рецептор антагонисты) катнашында 10-8 M яки 10-5 M DETA кулланылды. HUVEC белән дәвалау. pFHHSiD барлык концентрацияләрдә дә DETA пролифератив үзлекләрен тулысынча блоклады (1 нче таблица).
Бу шартларда без шулай ук DEETның HUVEC күзәнәкләрендә капилляр озынлыгын арттырачагын тикшердек. Шулай ук, pFHHSiD DEET китереп чыгарган капилляр озынлыгын сизелерлек рәвештә киметте (1a, b рәсем, соры полосалар). Моннан тыш, охшаш экспериментлар M3 siRNA белән үткәрелде. Контроль siRNA капиллярлар формалашуын стимуллаштыруда нәтиҗәле булмаса да, M3 мускарин рецепторын тындыру DEETның капилляр озынлыгын арттыру сәләтен юкка чыгарды (1a, b рәсем, кара полосалар).
Моннан тыш, 10-8 М яки 10-5 М DEET белән индукцияләнгән in vitro кан тамырлары һәм in vivo неоваскуляризация pFHHSiD тарафыннан тулысынча блокланган (1c, d рәсемнәр, түгәрәкләр). Бу нәтиҗәләр DEETның сайлап алынган M3 рецептор антагонистларына яки M3 siRNAга сизгер юл аша ангиогенезны стимуллаштыруын күрсәтә.
AChE - DEETның молекуляр максаты. AChE ингибиторлары булып эшләүче донепезил кебек препаратлар in vitro һәм тычканның арткы аяк-куллары ишемиясе модельләрендә EC ангиогенезын стимуллаштыра ала14. Без HUVECта AChE ферменты активлыгына DEETның ике концентрациясенең йогынтысын тикшердек. DEETның түбән (10-8 M) һәм югары (10-5 M) концентрацияләре контроль шартлар белән чагыштырганда эндотелиаль AChE активлыгын киметә (2 нче рәсем).
DEETның ике концентрациясе дә (10-8 M һәм 10-5 M) HUVECта ацетилхолинэстераза активлыгын киметкән. BW284c51 (10-5 M) ацетилхолинэстераза ингибиторлары өчен контроль буларак кулланылган. Нәтиҗәләр HUVECта DEETның ике концентрациясе белән эшкәртелгән AChE активлыгының транспорт чарасы белән эшкәртелгән күзәнәкләргә караганда проценты буларак күрсәтелгән. Кыйммәтләр алты бәйсез экспериментның уртача ± SEM буларак күрсәтелгән. Контроль белән чагыштырганда *p < 0,05 (Крускал-Уоллис һәм Данн күпсанлы чагыштыру тесты).
Азот оксиды (NO) ангиоген процесста 33 катнаша, шуңа күрә DEET белән стимуллаштырылган HUVECларда NO җитештерү өйрәнелде. DEET белән эшкәртелгән эндотелиаль NO җитештерү контроль күзәнәкләр белән чагыштырганда арттырылды, ләкин әһәмияткә 10-8 М дозада гына иреште (3c рәсем). DEET белән эшкәртелгән NO җитештерүне контрольдә тотучы молекуляр үзгәрешләрне билгеләү өчен, eNOS экспрессиясе һәм активлашуы Вестерн-блоттинг ярдәмендә анализланды. DEET белән эшкәртү eNOS экспрессиясен үзгәртмәсә дә, ул eNOS фосфорлашуындагы эшкәртелгән күзәнәкләр белән чагыштырганда активлаштыру урынында (Ser-1177) eNOS фосфорлашуын сизелерлек арттырды, ә ингибитор урынын (Thr-495) киметә (3d рәсем). Моннан тыш, активлаштыру урынында һәм ингибитор урынында фосфорлаштырылган eNOS нисбәте фосфорлаштырылган eNOS күләмен ферментның гомуми күләменә нормальләштергәннән соң исәпләнде. Бу нисбәт эшкәртелмәгән күзәнәкләр белән чагыштырганда DEETның һәр концентрациясе белән эшкәртелгән HUVECларда сизелерлек артты (3d рәсем).
Ниһаять, төп проангиоген факторларның берсе булган VEGF экспрессиясе Вестерн-блоттинг ярдәмендә анализланды. DEET VEGF экспрессиясен сизелерлек арттырды, ә pFHHSiD бу экспрессияне тулысынча блоклады.
DEET йогынтысы фармакологик блокадага да, M3 рецепторларының кимүенә дә сизгер булганлыктан, без DEET кальций сигналын көчәйтергә мөмкин дигән гипотезаны тикшердек. Гаҗәп, DEET кулланылган ике концентрация өчен дә HUVEC (мәгълүматлар күрсәтелмәгән) һәм HEK/M3 (4a, b рәсемнәр) цитоплазматик кальцийны арттыра алмады.
Бастырып чыгару вакыты: 2024 елның 30 декабре