Антелминтик препарат N, N-диэтил-м-толуамид (DEET) AChE (ацетилхолинестераз) ны тыя һәм артык кан тамырлары аркасында потенциаль карсиногеник үзенчәлекләргә ия. Бу кәгазьдә без күрсәтәбез, DEET ангиогенезга ярдәм итүче эндотелия күзәнәкләрен махсус стимуллаштыра, шуның белән шеш үсешен арттыра. DEET ангиогенезга китерә торган кәрәзле процессларны активлаштыра, шул исәптән таралу, миграция һәм ябышу. Бу Эндотелия күзәнәкләрендә NOК җитештерү һәм VEGF экспрессиясе белән бәйле. M3-ны тынычландыру яки фармакологик M3 ингибиторларын куллану бу барлык эффектларны бетерде, DEET-индивидуаль ангиогенезның M3-сизгер булуын күрсәтә. Эндотелия һәм HEK күзәнәкләрендә кальций сигнализациясе M3 рецепторларын чиктән тыш кысу, шулай ук бәйләү һәм туктату тикшеренүләре DEET M3 рецепторларының аллостерик модуляторы булып эшләвен күрсәтә. Моннан тыш, DEET AChE-ны тыя, шуның белән ацетилхолинның биоавеллылыгын һәм аның M3 рецепторлары белән бәйләнешен арттыра, һәм аллостерик көйләү аша проангиоген эффектларны көчәйтә.
Беренчел ЭК Швейцария тычканнары аорасыннан аерылды. Чыгару ысулы Кобаяши 26 протоколыннан җайлаштырылган. Мурин ЭКлары EBM-2 уртада культуралы булганнар, дүртенче юлга кадәр 5% җылылык-инактив булмаган FBS белән тулыландырылган.
DEETның ике концентрациясенең HUVEC, U87MG яки BF16F10 таралуга тәэсире CyQUANT күзәнәкләренең таралышын тикшерү комплекты ярдәмендә анализланды (Молекуляр пробалар, C7026). Кыскасы, коега 5.103 күзәнәк 96 кое тәлинкәгә чәчелде, бер төнгә бәйләнергә рөхсәт ителде, аннары DEET белән 24 сәг. Mediumсеш чарасын бетергәннән соң, микроплатаның һәр коесына буяу бәйләүче эремә кушыгыз һәм күзәнәкләрне 37 минутта 30 минутка инкубацияләгез. Флуоресцент дәрәҗәсе Mithras LB940 мультимодлы микроплит укучы (Бертольд Технологияләр, Начар Вилдбад, Германия) 485 нм дулкынландыргыч фильтрлар һәм 530 нм чыгару фильтрлары белән җиһазландырылган.
HUVEC 96 кое тәлинкәдә, бер коега 104 күзәнәк тыгызлыгында чәчелгән. Күзәнәкләр DEET белән 24 сәг. Күзәнәкнең яшәешчәнлеге колориметрик MTT анализы ярдәмендә бәяләнде (Сигма-Алдрич, M5655). Оптик тыгызлык кыйммәтләре мультимодлы микроплит укучыда (Mithras LB940) 570 нм дулкын озынлыгында алынган.
DEET эффектлары витро ангиогенез анализлары ярдәмендә өйрәнелде. 10-8 M яки 10-5 M DEET белән дәвалау HUVECларда капилляр озынлыгын формалаштырды (1а рәсем, б, ак барлар). Контроль төркем белән чагыштырганда, 10-14 - 10-5 М арасында DEET концентрацияләре белән эшкәртү капилляр озынлыгы 10-8 M DEET тәлинкәгә җиткәнен күрсәтте (өстәмә рәсем. S2). 10-8 М һәм 10-5 М концентрация диапазонында DEET белән эшкәртелгән HUVECларның витро проангиоген эффектында зур аерма табылмады.
DEETның новаскуляризациягә тәэсирен ачыклау өчен, без виво новаскулизация тикшеренүләрендә эшләдек. 14 көннән соң, 10-8 M яки 10-5 M DEET белән эшләнгән эндотелия күзәнәкләре белән тычканнар гемоглобин күләменең сизелерлек артуын күрсәттеләр (1с рәсем, ак барлар).
Моннан тыш, DEET-индуктив новаскулизация U87MG ксенографтлы тычканнарда өйрәнелде, алар көн саен (ip) DEET белән 10-5 M плазма концентрациясен китерә торган дозада инъекцияләнгән, ачыкланган кешеләрдә нормаль. Ачыкланган шешләр (ягъни шешләр> 100 мм3) U87MG күзәнәкләрен тычканнарга салганнан соң 14 көннән соң күзәтелә. 28 нче көнне, контроль тычканнар белән чагыштырганда, DEET белән эшләнгән тычканнарда шеш үсеше сизелерлек артты (1д рәсем, квадратлар). Моннан тыш, CD31 шешләр буяу күрсәтте, DEET капилляр мәйданын сизелерлек арттырды, ләкин микроэссель тыгызлыгын түгел. (1e - g).
DETA-индуктив таралуда мускариник рецепторларның ролен ачыклау өчен, 10-8 M яки 10-5 M DETA pFHHSiD булганда (10-7 M, сайлап алынган M3 рецептор антагонисты) кулланылды. HUVEC-ны дәвалау. pFHHSiD барлык концентрацияләрдә DETAның таралу үзлекләрен тулысынча блоклады (таблица 1).
Бу шартларда без шулай ук DEET HUVEC күзәнәкләрендә капилляр озынлыгын арттырырмы-юкмы икәнен тикшердек. Шулай ук, pFHHSiD DEET-индуктив капилляр озынлыгын сизелерлек кисәтте (1а рәсем, б, соры барлар). Моннан тыш, охшаш экспериментлар M3 siRNA белән үткәрелде. SiRNA контроле капиллярлар формалаштыруда эффектив булмаса да, M3 мускариник рецепторын тынлау DEETның капилляр озынлыгын арттыру мөмкинлеген бетерде (1а рәсем, б, кара барлар).
Моннан тыш, витродагы 10-8 M яки 10-5 M DEET-васкулизация һәм виводагы новаскулизация pFHHSiD белән тулысынча блокланган (1с рәсем, г, түгәрәкләр). Бу нәтиҗәләр шуны күрсәтә: DEET сайлап алынган M3 рецептор антагонистларына яки M3 siRNAга сизгер юл аша ангиогенезга ярдәм итә.
AChE - DEETның молекуляр максаты. AChE ингибиторы булып эшләгән донепезил кебек препаратлар витрода һәм тычканның арткы ишемия модельләрендә EC ангиогенезын стимуллаштыра ала14. Ике концентрация DEETның HUVECдагы AChE фермент эшчәнлегенә тәэсирен сынадык. Түбән (10-8 М) һәм югары (10-5 М) DEET концентрацияләре контроль шартлары белән чагыштырганда эндотелия AChE активлыгын киметтеләр (2 нче рәсем).
DEET концентрацияләренең икесе дә (10-8 М һәм 10-5 М) HUVEC буенча ацетилхолинестераз активлыгын киметтеләр. BW284c51 (10-5 M) ацетилхолинестераз ингибиторлары өчен контроль буларак кулланылган. Нәтиҗә HUVEC буенча AChE эшчәнлегенең процент рәвешендә күрсәтелә, машина белән эшкәртелгән күзәнәкләр белән чагыштырганда, DEETның ике концентрациясе белән эшкәртелә. Кыйммәтләр алты бәйсез экспериментның уртача ± SEM рәвешендә күрсәтелә. * p <0.05 контроль белән чагыштырганда (Крускал-Валлис һәм Данн чагыштыру тесты).
Азот оксиды (NOК) ангиогеник процесста катнаша 33, шуңа күрә DEET-стимуллаштырылган HUVECларда җитештерү юк. DEET белән эшкәртелгән эндотелия NO җитештерү контроль күзәнәкләр белән чагыштырганда артты, ләкин 10-8 М дозада гына әһәмияткә иреште (3с рәсем). DEET-индуктив NO производствосын контрольдә тотучы молекуляр үзгәрешләрне ачыклау өчен, eNOS экспрессиясе һәм активлашуы Көнбатыш блотлау белән анализланды. DEET белән эшкәртү eNOS экспрессиясен үзгәртмәсә дә, ул активлашкан мәйданда (Ser-1177) eNOS фосфориляциясен сизелерлек арттырды, шул ук вакытта eNOS фосфориляциясендә эшкәртелмәгән күзәнәкләр белән чагыштырганда (Thr-495) кимеде (3d рәсем). Моннан тыш, фосфориатланган eNOS активлаштыру мәйданында һәм ингибитор мәйданда фосфориатланган eNOS күләмен ферментның гомуми күләменә нормальләштергәннән соң исәпләнде. Бу катнашу DEU концентрациясе белән эшкәртелгән HUVECларда эшкәртелмәгән күзәнәкләр белән чагыштырганда сизелерлек артты (3d рәсем).
Ниһаять, төп проангиоген факторларның берсе булган VEGF экспрессиясе Көнбатыш блотлау белән анализланды. DEET VEGF экспрессиясен сизелерлек арттырды, ә pFHHSiD бу белдерүне тулысынча блоклады.
DEET эффектлары фармакологик блокадага да, M3 рецепторларының дегрегуляциясенә дә сизгер булганлыктан, без DEET кальций сигналын көчәйтә алырлык гипотезаны сынадык. Гаҗәп, DEET кулланылган ике концентрация өчен HUVEC (мәгълүматлар күрсәтелмәгән) һәм HEK / M3 (4а рәсем, б) цитоплазмик кальцийны арттыра алмады.
Пост вакыты: 30-2024 декабрь