Апик меристем (SAM) үсеше тамыр архитектурасы өчен бик мөһим. Antсемлек гормоннарыгиббереллиннар(GAs) үсемлек үсешен координацияләүдә төп роль уйныйлар, ләкин аларның SAMдагы роле начар аңлашыла. Монда, без GA сигнализациясенең ратиометрик биосенсорын эшләдек, DELLA белокын инженерлаштырып, GA транскрипция реакциясендә аның төп көйләү функциясен бастыру өчен, GA танылганда аның деградациясен саклап калдык. Без күрсәтәбез, бу деградациягә нигезләнгән биосенсор GA дәрәҗәсендәге үзгәрешләрне һәм кәрәзле сизү үсешен төгәл яза. Без бу биосенсорны SAMдагы GA сигнализация эшчәнлеген картага китерү өчен кулландык. Без күрсәтәбез, югары GA сигналлары күбесенчә интернод күзәнәкләренә прекурсор булган орган примордиясе арасында урнашкан күзәнәкләрдә бар. Функцияне югалту һәм югалту ысулларын кулланып, без тагын бер кат күрсәтәбез, GA күзәнәк бүленеше яссылыгының юнәлешен көйли, интеродларның каноник кәрәзле оешмасын булдыра, шуның белән SAMда интернод спецификациясен алга этәрә.
Ату очында урнашкан апикаль меристем (SAM), тамыр күзәнәкләрен үз эченә ала, аларның эшчәнлеге үсемлек гомере дәвамында модульле һәм iterative тәртиптә каптал органнарын һәм тамыр төеннәрен барлыкка китерә. Бу кабатлаучы берәмлекләрнең һәрберсе, яки үсемлек төеннәре, төеннәрдәге интеродлар һәм каптал органнары, һәм яфрак аксилларында аксиллари меристемалар бар1. Plantсемлек төеннәренең үсеше һәм оешуы үсеш вакытында үзгәрә. Арабидопсларда вегетатив этапта интернодаль үсеш кысыла, һәм аксиллари меристемнар розетка яфраклары аксилларында йокысыз кала. Чәчәк фазасына күчү вакытында SAM инфлоресцент меристемга әверелә, озын интеродлар һәм аксиллар куаклары, каулин яфраклары аксилендәге ботаклар, соңрак яфраксыз чәчәкләр2 барлыкка китерә. Яфраклар, чәчәкләр, ботаклар башлануны контрольдә тотучы механизмнарны аңлауда зур уңышларга ирешсәк тә, интеродларның ничек барлыкка килүе турында чагыштырмача аз билгеле.
ГАларның спатиотемпораль бүленешен аңлау бу гормоннарның функцияләрен төрле тукымаларда һәм төрле үсеш этапларында яхшырак аңларга ярдәм итәчәк. RGA-GFP кушылмасының деградациясен визуальләштерү, үз промоутеры эше белән күрсәтелгән, тамырларның гомуми GA дәрәҗәсен көйләү турында мөһим мәгълүмат бирә 15,16. Ләкин, RGA экспрессиясе тукымалар буенча үзгәрә17 һәм GA18 белән көйләнә. Шулай итеп, RGA промоутерының дифференциаль чагылышы RGA-GFP белән күзәтелгән флуоресцент формасына китерергә мөмкин һәм шулай итеп бу ысул санлы түгел. Күптән түгел, биоактив флуоресейн (Fl) тамгаланган GA19,20 тамыр эндокортексында GA туплануын һәм аның күзәнәк дәрәҗәсен GA транспорты белән көйләвен ачыклады. Күптән түгел, GA FRET сенсоры nlsGPS1 күрсәтте, GA дәрәҗәләре тамырларда, филаментларда һәм караңгы үскән гипокотилларда күзәнәк озынлыгы белән туры килә. Ләкин, күргәнебезчә, GA концентрациясе GA сигнализация эшчәнлеген контрольдә тотучы бердәнбер параметр түгел, чөнки бу катлаулы сизү процессларына бәйле. Монда, DELLA һәм GA сигнал юлларын аңлавыбызга нигезләнеп, без GA сигнализациясе өчен деградациягә нигезләнгән ратиометрик биосенсорның үсешен һәм характеристикасын хәбәр итәбез. Бу санлы биосенсорны үстерү өчен, без мутант GA сизгер RGA кулландык, ул флуоресцент протеинга кушылган һәм тукымаларда бөтен җирдә күрсәтелгән, шулай ук GA-сизгер флуоресцент белок. Без күрсәтәбез, мутант RGA белок кушылмалары бөтен җирдә күрсәтелгәндә эндоген GA сигнализациясенә комачауламый, һәм бу биосенсор GA кертү һәм GA сигналын эшкәртү нәтиҗәсендә сигнализация активлыгын югары спатиотемпор резолюциясе белән саный ала. Без бу биосенсорны GA сигнализация эшчәнлегенең спатиотемпораль бүленешен картага китерү өчен һәм GAның SAM эпидермисында кәрәзле тәртипне ничек көйләвен бәяләү өчен кулландык. Без күрсәтәбез, GA орган примордиясе арасында урнашкан SAM күзәнәкләренең бүленү яссылыгын юнәлеш итә, шуның белән интеродның каноник кәрәзле оешмасын билгели.
Ниһаять, без qmRGA үскән гипокотиллар кулланып эндоген GA дәрәҗәсендәге үзгәрешләр турында хәбәр итә аламы-юкмы дип сорадык. Элегерәк без күрсәткән идек, селитр GA синтезын арттырып, үз чиратында, DELLA34 деградациясен арттыра. Шуңа күрә, без pUBQ10 :: qmRGA үсентеләрендә гипокотил озынлыгы (10 мм NO3−) нитрат җитешмәгән шартларда үскән үсентеләргә караганда озынрак булганын күрдек (өстәмә рәсем 6а). Responseсеш реакциясенә туры китереп, GA сигналлары 10 мм NO3− шартларында үскән үсентеләрнең гипокотилларында нитрат булмаганда үскән үсентеләргә караганда югарырак иде (өстәмә рәсем 6б, с). Шулай итеп, qmRGA шулай ук GA концентрациясендә эндоген үзгәрешләр китереп чыгарган GA сигналындагы үзгәрешләрне күзәтергә мөмкинлек бирә.
QmRGA белән ачыкланган GA сигнализациясе GA концентрациясенә һәм GA кабул итүенә бәйлеме-юкмы икәнен аңлау өчен, сенсор дизайны нигезендә көтелгәнчә, без өч GID1 рецепторының вегетатив һәм репродуктив тукымаларда чагылышын анализладык. Чәчкечләрдә GID1-GUS хәбәрче линиясе GID1a һәм cның котиледоннарда югары чагылыш тапканын күрсәтте (3а - с). Моннан тыш, өч рецептор да яфракларда, каптал тамыр примордиясендә, тамыр очларында (GID1b тамыр капкасыннан кала) һәм тамыр системасында (3а - с) күрсәтелде. Информацион SAMда без GUS сигналларын GID1b һәм 1c өчен генә ачыкладык (өстәмә рәсем 7a - c). Ситу гибридизациясе бу экспресс формаларын раслады һәм GID1cның SAMда түбән дәрәҗәдә бертөрле чагылыш тапканын күрсәтте, ә GID1b SAM перифериясендә югары күрсәткеч күрсәтте (өстәмә рәсем 7d - l). PGID1b :: 2xmTQ2-GID1b тәрҗемә кушылуы шулай ук SID үзәгендә түбән яки юк экспрессиядән орган чикләрендә югары экспрессиягә кадәр GID1b экспрессиясенең дәрәҗә диапазонын ачты (өстәмә рәсем 7м). Шулай итеп, GID1 рецепторлары тукымалар арасында һәм бертөрле таралмыйлар. Киләсе экспериментларда без шулай ук күзәттек: GID1 (pUBQ10 :: GID1a-mCherry) чиктән тыш кысылу гипокотилларда qmRGAның тышкы GA кушымтасына сизгерлеген арттырды (3d рәсем, д). Киресенчә, гипокотилда qd17mRGA белән үлчәнгән флуоресцент GA3 дәвалауга сизгер булмаган (3ф рәсем, г). Ике анализ өчен дә үсентеләр сенсорның тиз тотышын бәяләү өчен GA (100 μM GA3) концентрацияләре белән эшкәртелде, монда GID1 рецепторына бәйләү сәләте көчәйтелде яки югалды. Бергәләп, бу нәтиҗәләр qmRGA биосенсорының GA һәм GA сенсоры буларак берләштерелгән функциягә хезмәт итүен раслый, һәм GID1 рецепторының дифференциаль чагылышы сенсорның эмиссивлыгын сизелерлек үзгәртә ала.
Бүгенге көнгә SAMда GA сигналларының бүленеше аңлашылмый кала. Шуңа күрә, без Q1 сигнализация эшчәнлегенең югары резолюцияле санлы карталарын исәпләү өчен qmRGA экспрессив үсемлекләр һәм pCLV3 :: mCherry-NLS кулландык, L1 катламына игътибар итәбез (эпидермис; 4а рәсем, б, методлар һәм өстәмә ысуллар), чөнки L1 SAM үсешен контрольдә тотуда мөһим роль уйный36. Монда, pCLV3 :: mCherry-NLS экспрессиясе GA сигнализация эшчәнлегенең спатиотемпораль бүленешен анализлау өчен тотрыклы геометрик белешмә ноктасы бирде37. GA латаль орган үсеше өчен мөһим дип саналса да, без GA сигналларының чәчәк примордиумында (P) P3 этаптан башлап түбән булуын күрдек (4а, б), ә яшь P1 һәм P2 примордиумнары үзәк төбәктәге охшаш активлыкка ия (4а рәсем, б). Gгары GA сигнализациясе орган примордиум чикләрендә, P1 / P2 (чик ягында) һәм P4 иң югары ноктада, шулай ук примордия арасында урнашкан периферия өлкәсенең барлык күзәнәкләрендә ачыкланды (4а рәсем, б һәм өстәмә рәсем 8а, б). Бу югары GA сигнализациясе эпидермиста гына түгел, L2 һәм өске L3 катламнарында да күзәтелә (өстәмә рәсем 8б). QmRGA кулланып SAMда ачыкланган GA сигналларының үрнәге дә вакыт узу белән үзгәрешсез калды (өстәмә рәсем 8c - f, k). Qd17mRGA конструкциясе T3 үсемлекләренең SAM системасында системалы рәвештә регуляцияләнгән булса да, без җентекләп характеристика бирдек, без pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP конструкциясе белән алынган флюоресенция үрнәкләрен анализлый алдык (өстәмә рәсем 8g - j, l). Бу контроль линиядә флюоресенция коэффициентында кечкенә үзгәрешләр генә ачыкланды, ләкин SAM үзәгендә без TagBFP белән бәйле VENUSның ачык һәм көтелмәгән кимүен күрдек. Бу qmRGA күзәткән сигнализация үрнәгенең GA-бәйләнешле mRGA-VENUS деградациясен чагылдыруын раслый, ләкин шулай ук qmRGA меристем үзәгендә GA сигнализация эшчәнлеген бәяләп бетерә алуын күрсәтә. Йомгаклап әйткәндә, безнең нәтиҗәләр GA сигнализация үрнәген ачалар, ул беренче чиратта примордия бүленешен чагылдыра. Примордиаль төбәкнең (IPR) бу бүленеше үсә барган примордиум белән үзәк төбәк арасында әкренләп GA сигнализация эшчәнлегенең барлыкка килүенә бәйле, шул ук вакытта примордиумдагы GA сигнализациясе кими (4с рәсем, д).
GID1b һәм GID1c рецепторларының бүленеше (өстә карагыз) GA рецепторларының дифференциаль чагылышы SAMда GA сигнализациясе эшчәнлеген формалаштырырга ярдәм итә. GA-ның дифференциаль туплануы катнашырга мөмкинме дип уйладык. Бу мөмкинлекне тикшерү өчен, без nlsGPS1 GA FRET сенсорын кулландык. Арту активлыгы ешлыгы 10 μM GA4 + 7 белән эшкәртелгән nlsGPS1 SAMда табылды (өстәмә рәсем 9a - e), бу nlsGPS1 SAMдагы GA концентрациясенең үзгәрүенә җавап бирә, тамырдагы кебек. NlsGPS1 активлаштыру ешлыгының киң таралуы SAMның тышкы катламнарында чагыштырмача түбән GA дәрәҗәсен ачыклады, ләкин аларның үзәктә һәм SAM чикләрендә күтәрелүен күрсәтте (4e рәсем һәм өстәмә рәсем 9а, с). Бу GA шулай ук qmRGA ачкан белән чагыштырырлык киңлек үрнәге белән SAMда таратылуын күрсәтә. Бер-берсен тулыландыручы алым буларак, без шулай ук SAMны флюоресцент GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) яки Fl белән тискәре контроль итеп эшләдек. Fl сигналы түбән интенсивлыкта булса да, үзәк төбәк һәм примордиумны кертеп, SAM буенча таратылды (4j рәсем һәм өстәмә рәсем 10d). Моннан аермалы буларак, өч GA-Fl да примордиум чикләрендә һәм IPRның калган өлешләрендә төрле дәрәҗәләрдә тупланганнар, GA7-Fl IPRның иң зур доменында тупланганнар (4к рәсем һәм өстәмә рәсем 10а, б). Флуоресенция интенсивлыгы күләме IPR булмаган IP-интенсивлык коэффициенты GA-Fl белән эшкәртелгән SAMда Fl-эшкәртелгән SAM белән чагыштырганда югарырак булуын күрсәтте (4л рәсем һәм өстәмә рәсем 10c). Бергәләп, бу нәтиҗәләр шуны күрсәтә: GA органнар чикләренә иң якын урнашкан IPR күзәнәкләрендә югары концентрацияләрдә. Бу SAM GA сигнализация эшчәнлегенең үрнәге GA рецепторларының дифференциаль чагылышы һәм орган чикләре янындагы IPR күзәнәкләрендә дифференциаль туплану нәтиҗәсе булуын күрсәтә. Шулай итеп, безнең анализ GA сигнализациясенең көтелмәгән спатиотемпораль үрнәген ачты, үзәктә түбән активлык һәм SAM примордиумы һәм периферия өлкәсендә IPRда югары активлык.
SAMдагы дифференциаль GA сигнализация эшчәнлегенең ролен аңлар өчен, без GA сигнализациясе, күзәнәкнең киңәюе һәм күзәнәк бүленеше арасындагы корреляцияне анализладык, SAM qmRGA pCLV3 :: mCherry-NLS. Growthсешне көйләүдә GA ролен исәпкә алып, күзәнәкнең киңәю параметрлары белән уңай бәйләнеш көтелә. Шуңа күрә без башта GA сигнализация эшчәнлеге карталарын күзәнәк өслегенең үсеш темплары карталары белән чагыштырдык (билгеле бер күзәнәк өчен һәм бүленгән кыз күзәнәкләре өчен күзәнәкнең киңәю көченә прокси буларак) һәм күзәнәкнең киңәю юнәлешен үлчәүче үсеш анисотропы карталары белән (монда бирелгән күзәнәк өчен һәм бүленештә кыз күзәнәкләре өчен дә кулланыла; 5а, б, методлар һәм өстәмә ысуллар). Безнең SAM күзәнәк өслегенең үсеш темплары алдагы күзәтүләр белән туры килә, 38,39, чик буенда минималь үсеш темплары һәм чәчәкләр үсүдә максималь үсеш темплары (5а рәсем). Төп компонент анализы (PCA) күрсәтте, GA сигнализациясе активлыгы күзәнәк өслегенең үсеш интенсивлыгы белән тискәре корреляцияләнгән (5 нче рәсем). Без шулай ук күрсәткәнчә, төп үзгәрү күчәре, шул исәптән GA сигнал кертү һәм үсеш интенсивлыгы, югары CLV3 экспрессия белән билгеләнгән юнәлештә ортогональ булган, калган анализларда күзәнәкләрнең SAM үзәгеннән чыгарылуын раслаган. Spearman корреляцион анализ PCA нәтиҗәләрен раслады (5d рәсем), бу IPRдагы югары GA сигналларының күзәнәкнең киңәюенә китермәвен күрсәтә. Ләкин, корреляцион анализ GA сигнализациясе һәм үсеш анисотропиясе арасында бераз уңай корреляцияне ачыклады (5с, г), бу IPRда югары GA сигнализациясе күзәнәк үсешенә һәм, мөгаен, күзәнәк бүленеше яссылыгына тәэсир итә.
а, б уртача өслекнең җылылык карталары (а) һәм анисотропия (б) SAMда уртача җиде мөстәкыйль үсемлек (тиешенчә күзәнәк киңәю көче һәм юнәлеше өчен прокси буларак кулланыла). c PCA анализы түбәндәге үзгәрешләрне үз эченә алган: GA сигналы, өслекнең үсеш интенсивлыгы, өслек үсеш анисотропиясе һәм CLV3 экспрессиясе. PCA компоненты 1, нигездә, өслекнең үсеш интенсивлыгы белән тискәре корреляцияләнгән һәм GA сигналы белән уңай корреляцияләнгән. PCA компоненты 2, нигездә, өслек үсеше анисотропиясе белән уңай корреляцияләнгән һәм CLV3 экспрессиясе белән тискәре корреляцияләнгән. Процентлар һәр компонент белән аңлатылган вариацияне күрсәтәләр. d GA сигналы, өслекнең үсеш интенсивлыгы, CZны исәпкә алмаганда, тукымалар масштабында анисотропия арасындагы корреляцион анализ. Уңдагы сан - ике үзгәрүчән арасындагы Spearman rho кыйммәте. Йолдызлыклар корреляция / тискәре корреляциянең бик мөһим булган очракларын күрсәтәләр. e Col-0 SAM L1 күзәнәкләрен конокаль микроскопия ярдәмендә 3D визуализацияләү. SAMда барлыкка килгән яңа күзәнәк стеналары (ләкин примордиум түгел) 10 сәгатьтә почмак кыйммәтләре буенча төсле. Төс төсе уң уң почмакта күрсәтелгән. Инсетта 0 сәгатьтә тиешле 3D рәсем күрсәтелә. Эксперимент охшаш нәтиҗәләр белән ике тапкыр кабатланды. f Касса участоклары IPR һәм IPR булмаган Col-0 SAMда күзәнәк бүленеше темпларын күрсәтәләр (n = 10 бәйсез үсемлек). Centerзәк сызык уртача күрсәтә, һәм тартма чикләре 25 һәм 75 процентларны күрсәтә. Сызгычлар R программа тәэминаты белән билгеләнгән минималь һәм максималь кыйммәтләрне күрсәтәләр. P кыйммәтләре Велчның ике койрыклы т-тесты белән алынган. g, h Схематик схема (g) яңа күзәнәк стенасының (магнита) почмагын SAM үзәгеннән радиаль юнәлешкә (ак нокталы сызык) ничек үлчәргә икәнен күрсәтә (кискен почмак кыйммәтләре, ягъни 0–90 ° гына карала), һәм (h) меристем эчендә әйләнә / каптал һәм радиаль юнәлешләр. i SAM (куе зәңгәр), IPR (урта зәңгәр), һәм IPR булмаган (ачык зәңгәр) буенча күзәнәк бүленеше яссылык ориентациясенең ешлык гистограммалары. P кыйммәтләре ике койрыклы Колмогоров-Смирнов тесты белән алынган. Эксперимент охшаш нәтиҗәләр белән ике тапкыр кабатланды. j P3 (ачык яшел), P4 (урта яшел), һәм P5 (куе яшел) тирәсендә IPR күзәнәк бүленеше яссылык ориентациясенең ешлык гистограммалары. P кыйммәтләре ике койрыклы Колмогоров-Смирнов тесты белән алынган. Эксперимент охшаш нәтиҗәләр белән ике тапкыр кабатланды.
Шуңа күрә, без алга таба GA сигнализациясе һәм күзәнәк бүленеше эшчәнлеге арасындагы корреляцияне тикшердек, анализ вакытында яңа барлыкка килгән күзәнәк стеналарын ачыкладык (5e рәсем). Бу ысул безгә күзәнәк бүленешенең ешлыгын һәм юнәлешен үлчәргә мөмкинлек бирде. Гаҗәп, без IPR һәм калган SAMдагы күзәнәк бүленешләренең ешлыгы (IPR булмаган, 5ф рәсем) охшаш булуын ачыкладык, бу IPR һәм IPR булмаган күзәнәкләр арасында GA сигнализациясенең аермалары күзәнәк бүленешенә зур йогынты ясамаганын күрсәтә. Бу, һәм GA сигнализациясе һәм үсеш анисотропиясе арасындагы уңай корреляция безне GA сигнализациясе күзәнәк бүленеше яссылыгына юнәлтә аламы-юкмы икәнлеген уйларга этәрде. Без яңа күзәнәк стенасының юнәлешен меристем үзәген һәм яңа күзәнәк стенасының үзәген тоташтыручы радиаль күчәренә карата кискен почмак итеп үлчәттек һәм күзәнәкләрнең радиаль күчәренә карата 90 ° ка якын почмакларда бүленүенең ачык тенденциясен күзәттек, иң югары ешлыклар 70-80 ° (23,28%) һәм 80–90 ° (22,6%). 5с). GA сигнализациясенең бу күзәнәк бүленеше тәртибенә керткән өлешен тикшерү өчен, без IPR һәм IPR булмаган күзәнәк бүленеше параметрларын анализладык (5i рәсем). Без күзәттек, IPR күзәнәкләрендә бүленү почмагы бүленеше IPR булмаган күзәнәкләрдә яки бөтен SAM күзәнәкләрендә аерылып тора, IPR күзәнәкләре каптал / түгәрәк күзәнәк бүленешләренең зур өлешен күрсәтәләр, ягъни 70-80 ° һәм 80–90 ° (тиешенчә пропорцияләр) (5i рәсем). Шулай итеп, безнең күзәтүләр югары GA сигнализациясе һәм әйләнә-тирә юнәлешкә якын күзәнәк бүленеше яссылыгы арасындагы ассоциацияне ачыкладылар, GA сигнализациясе һәм үсеш анисотропиясе арасындагы корреляциягә охшаш (5с рәсем, г). Бу ассоциациянең киңлек саклауын тагын да ныгыту өчен, без P3-дән башлап примордиумны әйләндереп алган IPR күзәнәкләрендә дивизион яссылык ориентациясен үлчәдек, чөнки бу төбәктә иң югары GA сигнализациясе P4-дән башланган (4 нче рәсем). P3 һәм P4 тирәсендә IPRның бүлү почмаклары статистик яктан мөһим аермалар күрсәтмәделәр, гәрчә капиталь күзәнәк бүленешләренең ешлыгы IPRда P4 тирәсендә күзәтелде (5j рәсем). Ләкин, P5 тирәсендәге IPR күзәнәкләрендә, күзәнәк бүленеше яссылыгының юнәлешендәге аерма статистик яктан әһәмиятле булды, аркылы күзәнәк бүленешләренең ешлыгы кискен артты (5j рәсем). Бергәләп, бу нәтиҗәләр GA сигнализациясе SAMдагы күзәнәк бүленешләренең ориентациясен контрольдә тота алуын күрсәтә, бу элекке докладларга туры килә40,41, югары GA сигнализациясе IPR күзәнәк бүленешләренең капиталь юнәлешен китерә ала.
IPR күзәнәкләре примордиягә түгел, ә интернодларга кертеләчәк дип фаразлана2,42,43. IPRдагы күзәнәк бүленешләренең аркылы юнәлеше интеродларда эпидермаль күзәнәкләрнең параллель озын юлларын типик оештыруга китерергә мөмкин. Aboveгарыда тасвирланган күзәтүләребез шуны күрсәтә: GA сигнализациясе, мөгаен, күзәнәк бүленеше юнәлешен көйләп, бу процесста роль уйный.
Берничә DELLA генының функциясен югалту GA реакциясенә китерә, һәм бу гипотезаны сынау өчен делла мутантлар кулланылырга мөмкин44. Без башта SAMдагы биш DELLA генның экспрессия үрнәкләрен анализладык. GUS линиясенең транскрипция кушылуы GAI, RGA, RGL1, һәм RGL2 (күпкә азрак) SAMда күрсәтелүен күрсәтте (өстәмә рәсем 11а - d). Ситу гибридизациясендә GAI mRNA махсус примордиядә туплануы һәм чәчәкләр үсүе күрсәтелде (өстәмә рәсем 11e). RGL1 һәм RGL3 mRNA SAM түбәсендә һәм олы чәчәкләрдә ачыкланган, ә RGL2 mRNA чик буенда күбрәк булган (өстәмә рәсем 11f - с). PRGL3 конфокаль тасвирлау :: RGL3-GFP SAM ситу гибридизациясендә күзәтелгән сүзләрне раслады һәм RGL3 белокының SAM үзәк өлешендә җыелганын күрсәтте (өстәмә рәсем 11i). PRGA :: GFP-RGA сызыгын кулланып, без шулай ук RGA белокының SAMда җыелганын ачыкладык, ләкин аның муллыгы P4-дән башлап чик буенда кими (өстәмә рәсем 11j). Шунысы игътибарга лаек, RGL3 һәм RGA экспрессия үрнәкләре IPRдагы югары GA сигнализация эшчәнлегенә туры килә, qmRGA тарафыннан ачыкланган (4 нче рәсем). Моннан тыш, бу мәгълүматлар барлык DELLA'ларның SAM'да күрсәтелүен һәм аларның экспрессиясенең бөтен SAMны үз эченә алганын күрсәтәләр.
Алга таба без кыргый типтагы SAM (Ler, контроль) һәм gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (глобаль) мутантларда күзәнәк бүленеше параметрларын анализладык (6а, б). Кызык, без делла глобаль мутант SAMда күзәнәк бүленеше почмак ешлыкларын бүлүдә статистик яктан мөһим үзгәрешне күзәттек (6с рәсем). Делла глобаль мутантның бу үзгәреше 80–90 ° почмакларның ешлыгының артуы белән бәйле (34,71% - 24.55%) һәм азрак дәрәҗәдә 70–80 ° почмаклар (23,78% - 20,18%), ягъни трансверс күзәнәк бүленешләренә туры килә (6с рәсем). Делла глобаль мутантта трансверс булмаган бүленешләрнең ешлыгы (0–60 °) түбән иде (6с рәсем). Делла глобаль мутантның SAMында трансверс күзәнәк бүленешләренең ешлыгы сизелерлек артты (6б рәсем). IPRдагы трансверс күзәнәк бүленешләренең ешлыгы делла глобаль мутантында кыргый төр белән чагыштырганда югарырак иде (6-нчы рәсем). IPR өлкәсеннән тыш, кыргый тип күзәнәк бүленеш почмакларының бертөрле бүленеше булган, ә делла глобаль мутант IPR кебек тангеналь бүленешләрне өстен күргән (6-нчы рәсем). Без шулай ук GA2 оксидасы (ga2ox) квинтупле мутацияләр (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, һәм ga2ox6-2) күзәнәк бүленешләренең юнәлешен бәяләдек, GA тупланган актив булмаган мутант фон. GA дәрәҗәсенең артуы белән эзлекле, ga2ox мутант инфлоресенциясенең SAM Col-0ныкыннан зуррак иде (өстәмә рәсем 12а, б), һәм Col-0 белән чагыштырганда, ga2ox SAM күзәнәк бүленеше почмакларының аерылып торуын күрсәтте, почмак ешлыгы 50 ° тан 90 ° ка кадәр артты, ягъни кабат тангеналь бүленешләргә өстенлек бирде. Шулай итеп, без күрсәтәбез, GA сигнализациясен һәм GA туплануны конструктив активлаштыру IPR һәм SAMның калган өлешендә күзәнәк бүленешләрен китерә.
a, b PI-буялган Ler катламының L1 катламын һәм глобаль делла мутанты (b) SAM конфокаль микроскопия ярдәмендә визуализация. 10 сәгать эчендә SAMда барлыкка килгән яңа күзәнәк стеналары (ләкин примордиум түгел) күрсәтелә һәм почмак кыйммәтләре буенча төсле. Инсетта SAMны 0 сәг. Төс төсе уң уң почмакта күрсәтелә. (B) эчендәге ук глобаль делла мутантында тигезләнгән күзәнәк файллары мисалын күрсәтә. Эксперимент охшаш нәтиҗәләр белән ике тапкыр кабатланды. LER һәм глобаль делла арасында бөтен SAM (d), IPR (e), һәм IPR булмаган (f) күзәнәк бүленеше яссылык ориентацияләренең еш бүленешен чагыштыру. P кыйммәтләре ике койрыклы Колмогоров-Смирнов тесты ярдәмендә алынган. f, g Col-0 (i) һәм pCUC2 :: gai-1-VENUS (j) трансген үсемлекләренең PI-буялган SAM конфокаль рәсемнәрен 3D визуализацияләү. Панельләр (а, б) 10 сәгать эчендә SAMда барлыкка килгән яңа күзәнәк стеналарын күрсәтәләр (ләкин примордия түгел). Эксперимент охшаш нәтиҗәләр белән ике тапкыр кабатланды. h - j Бөтен SAM (h), IPR (i) һәм IPR булмаган (j) урнашкан күзәнәк бүленеше яссылык ориентацияләренең еш бүленешен чагыштыру Col-0 һәм pCUC2 :: gai-1-VENUS үсемлекләре. P кыйммәтләре ике койрыклы Колмогоров - Смирнов тесты ярдәмендә алынган.
Алга таба без махсус IPRда GA сигнализациясен тыю эффектын сынадык. Бу максаттан, без VENUSга кушылган доминант тискәре гай-1 протеинын чагылдыру өчен котиледон касәсе 2 (CUC2) промоутерын кулландык (pCUC2 :: gai-1-VENUS сызыгында). Кыргый типтагы SAMда, CUC2 промоутеры SAM-ның күпчелек IPR-ларын чагылдыра, шул исәптән чик күзәнәкләрен, P4-дән алып, һәм охшаш конкрет белдерү pCUC2 :: gai-1-VENUS үсемлекләрендә күзәтелә (аста карагыз). PCUC2 :: gai-1-VENUS үсемлекләренең SAM яки IPR аша күзәнәк бүленеше почмакларының бүленеше кыргый типныкыннан әллә ни аерылып тормады, көтмәгәндә без бу үсемлекләрдә IPR булмаган күзәнәкләрнең 80–90 ° югары ешлыкта бүленүен ачыкладык (6f - j).
Күзәнәк бүленеше юнәлеше SAM геометриясенә, аеруча тукыманың кәкрелеге аркасында барлыкка килгән киеренке стресска бәйле дигән тәкъдим бар. Шуңа күрә без SAM формасы делла глобаль мутант һәм pCUC2 :: gai-1-VENUS заводларында үзгәртелгәнме дип сорадык. Элегерәк хәбәр ителгәнчә, делла глобаль мутант SAM зурлыгы кыргый төрдән зуррак иде (өстәмә рәсем 13а, б, г). CLV3 һәм STM RNA ситу гибридизациясендә делла мутацияләрендә меристемның киңәюен расладылар һәм тамыр клеткаларының ян ягыннан киңәюен күрсәттеләр (өстәмә рәсем 13e, f, h, i). Ләкин, SAM кәкрелеге ике генотипта да охшаш иде (өстәмә рәсем 13к, м, п, р). Gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 делла дүртпочмаклы мутантның охшаш үсешен күзәттек, кыргый төр белән чагыштырганда иярү үзгәрмичә (өстәмә рәсем 13c, d, g, j, l, o, p). Күзәнәк бүленешенең ешлыгы делла дүртпочмаклы мутантка да кагылды, ләкин делла монолит мутанты белән чагыштырганда азрак дәрәҗәдә (өстәмә рәсем 12d - f). Бу доза эффекты, кәкрелеккә эффект булмау белән, Делла дүртпочмаклы мутанттагы RGL3 активлыгы DELLA активлыгын югалту аркасында күзәнәк бүленеше юнәлешендәге үзгәрешләрне чикли һәм SAM геометриясе үзгәрүенә түгел, GA сигнал эшчәнлегенең үзгәрүенә җавап бирә. Aboveгарыда тасвирланганча, CUC2 промоутеры P4-дән башлап SAM-та IPR экспрессиясен йөртә (өстәмә рәсем 14а, б), һәм киресенчә, pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM зурлыгы кимеде, ләкин зуррак иярү (өстәмә рәсем 14c - с). PCUC2 :: gai-1-VENUS SAM морфологиясендәге бу үзгәреш кыргый тип белән чагыштырганда механик стрессларның бүтән таралуына китерергә мөмкин, бу әйләнә-тирә стресслар SAM үзәгеннән кыска ераклыкта башлана47. Альтернатив рәвештә, pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM морфологиясендәге үзгәрешләр трансген экспрессиясе аркасында региональ механик үзлекләр үзгәрүеннән булырга мөмкин48. Ике очракта да бу GA сигнализациясендәге үзгәрешләрнең эффектларын өлешчә каплый ала, күзәтүләребезне аңлатып, күзәнәкләрнең әйләнә / трансверсия юнәлешенә бүленү ихтималын арттырып.
Бергә тупланганнан соң, безнең мәгълүматлар раслый, югары GA сигнализациясе IPR күзәнәк бүленеше яссылыгының латаль юнәлешендә актив роль уйный. Алар шулай ук күрсәтәләр, меристем кәкрелеге IPRдагы күзәнәк бүленеше яссылыгына юнәлеш бирә.
ИПРдагы дивизион яссылыгының трансверт юнәлеше, GA сигнализациясе югары булганга, GA эпидермалда радиаль күзәнәк файлын алдан оештыра, соңрак эпидермаль интеродта табылачак кәрәзле оешманы билгеләү өчен. Чыннан да, мондый күзәнәк файллары делла глобаль мутацияләрнең SAM рәсемнәрендә еш күренде (6б рәсем). Шулай итеп, SAMдагы GA сигнализациясенең киңлек үрнәгенең үсеш функциясен өйрәнү өчен, без кыргый типтагы (Ler һәм Col-0), делла глобаль мутацияләр, һәм pCUC2 :: gai-1-VENUS трансген үсемлекләрендәге IPR күзәнәкләренең киң оешуын анализлау өчен вакыт аралыгында сурәтләү кулландык.
QmRGA күрсәткәнчә, IPRдагы GA сигнализация активлыгы P1 / P2-тан арткан һәм P4-та иң югары булган, һәм бу үрнәк вакыт узу белән даими калган (4а - f һәм өстәмә рәсем 8c - f, k). GA сигналының артуы белән IPR күзәнәкләренең киң оештырылуын анализлау өчен, без Ler IPR күзәнәкләрен өстә һәм P4 ягына билгеләдек, аларның үсеш язмышы буенча беренче күзәтүдән соң 34 сәгать анализ ясалды, ягъни ике пластик вакыттан артык, безгә примордиум үсеше вакытында IPR күзәнәкләрен P1 / P2 дән P4 кадәр күзәтергә мөмкинлек бирде. Без өч төрле төс кулландык: P4 янындагы примордиумга интеграцияләнгән күзәнәкләр өчен сары, IPR булганнары өчен яшел, ике процесста катнашканнар өчен кызгылт төс (7а - с). T0 (0 с), P4 алдында 1-2 катлам IPR күзәнәкләре күренде (7а рәсем). Көтелгәнчә, бу күзәнәкләр бүленгәч, алар моны, нигездә, трансверс дивизион яссылыгы аша ясадылар (7а - с). Охшаш нәтиҗәләр Col-0 SAM ярдәмендә алынган (P3-ка юнәлтелгән, аның чикләре Лердагы P4 белән охшаган), ләкин бу генотипта чәчәк чигендә барлыкка килгән катлам IPR күзәнәкләрен тизрәк яшергән (7g - i). Шулай итеп, IPR күзәнәкләренең бүленү үрнәге күзәнәкләрне интеродлардагы кебек радиаль рәтләргә алдан оештыра. Радиаль рәтләрне оештыру һәм бер-бер артлы органнар арасында IPR күзәнәкләрен локализацияләү бу күзәнәкләрнең интернодаль токымнар булуын күрсәтә.
Монда без ратиометрик GA сигнализация биосенсоры, qmRGA эшләдек, бу GA сигнализация эшчәнлегенең санлы картасын ясарга мөмкинлек бирә, берләштерелгән GA һәм GA рецептор концентрацияләре нәтиҗәсендә, эндоген сигнал юлларына комачаулыкны киметеп, кәрәзле дәрәҗәдә GA функциясе турында мәгълүмат бирә. Бу максаттан, без үзгәртелгән DELLA белок, mRGA төзедек, ул DELLA үзара бәйләнеш партнерларын бәйләү сәләтен югалтты, ләкин GA китергән протеолизга сизгер булып кала. qmRGA GA дәрәҗәсендәге экзоген һәм эндоген үзгәрешләргә җавап бирә, һәм аның динамик сизү үзенчәлекләре үсеш вакытында GA сигнализация эшчәнлегендә спатиотемпораль үзгәрешләрне бәяләргә мөмкинлек бирә. qmRGA шулай ук бик сыгылучан корал, чөнки аны белдерү өчен кулланылган промоторны үзгәртеп, төрле тукымаларга яраклаштырып була, һәм GA сигнал юлының сакланган табигатен һәм ангиоспермалар аша PFYRE мотивын исәпкә алып, ул башка төрләргә күчү ихтималы22. Моның белән туры килгәндә, SLR1 DELLA протеинында (HYY497AAA) эквивалент мутация шулай ук SLR1 үсеш репрессор активлыгын басу өчен күрсәтелде, шул ук вакытта аның GA-арадаш деградациясен бераз киметеп, mRGA23 охшаган. Шунысы игътибарга лаек, соңгы вакытта Arabidopsis тикшеренүләре күрсәткәнчә, PFYRE доменындагы бер аминокислота мутациясе (S474L) RGA транскрипция эшчәнлеген үзгәртте, аның транскрипция факторы партнерлары белән үзара бәйләнешенә тәэсир итмичә50. Бу мутация mRGAда булган 3 аминокислотаны алыштыруга бик якын булса да, безнең тикшеренүләр шуны күрсәтә: бу ике мутация DELLAның үзенчәлекләрен үзгәртә. Күпчелек транскрипция факторы партнерлары DELLA26,51 LHR1 һәм SAW доменнары белән бәйләнештә булса да, PFYRE доменындагы кайбер сакланган аминокислоталар бу үзара бәйләнешне тотрыклыландырырга булыша ала.
Интерод үсеше үсемлек архитектурасында һәм уңышны яхшыртуда төп үзенчәлек. qmRGA IPR интерод прогенитор күзәнәкләрендә югары GA сигнал активлыгын ачты. Санлы сурәтләү һәм генетиканы берләштереп, без GA сигнализация үрнәкләренең SAM эпидермисында түгәрәк / трансверс күзәнәк бүленеше самолетларын суперимпозлавын күрсәттек, интерод үсеше өчен кирәк булган күзәнәк бүленеше оешмасын формалаштырдылар. Cellсеш вакытында күзәнәк бүленешенең яссылык юнәлешенең берничә регуляторы ачыкланды52,53. Безнең эш GA сигнализация эшчәнлегенең бу кәрәзле параметрны ничек көйләвенең ачык мисалы. DELLA префолдинг белок комплекслары белән үзара бәйләнештә булырга мөмкин41, шуңа күрә GA сигнализациясе корталь микротубул ориентациясенә турыдан-туры тәэсир итеп күзәнәк бүленеше яссылыгын көйли ала40,41,54,55. Без көтмәгәндә күрсәттек, SAM-да югары GA сигнализациясе корреляциясе күзәнәкнең озынлыгы яки бүленеше түгел, ә үсеш анисотропиясе, бу GA-ның IPR күзәнәк бүленеше юнәлешенә туры эффектына туры килә. Ләкин, без бу эффектның турыдан-туры булырга мөмкинлеген дә искәртә алмыйбыз, мәсәлән, GA-индуктив күзәнәк стенасын йомшарту белән арадашлашу56. Күзәнәк стенасы үзлекләренең үзгәрүе механик стресс тудыра 57,58, бу шулай ук корталь микротубулларның ориентациясенә тәэсир итеп күзәнәк бүленеше яссылыгына юнәлеш бирә ала 39,46,59. Г. Шулай ук, алдагы тикшеренүләр DELLA-үзара тәэсир итүче TCP14 һәм 15 белгечләренең интернод формалашу контролендә мөһимлеген күрсәттеләр 60,61 һәм бу факторлар GA эшен BREVIPEDICELLUS (BP) һәм PENNYWISE (PNY) белән арадашлаштырырга мөмкин, алар интернод үсешен көйлиләр һәм GA сигнализациясенә тәэсир итәләр. DELLAларның брассиностероид, этилен, яшмон кислотасы, һәм абсцис кислотасы (ABA) сигнал юллары 63,64 белән үзара бәйләнештә булуын һәм бу гормоннарның микротубул ориентациясенә тәэсир итә алуын исәпкә алып, GA-ның күзәнәк бүленеше ориентациясенә башка гормоннар арадаш булырга мөмкин.
Баштагы цитологик тикшеренүләр күрсәткәнчә, интернод үсеше өчен Arabidopsis SAMның эчке һәм тышкы регионнары кирәк. GA эчке тукымалардагы күзәнәк бүленешен актив рәвештә көйли12, SAMдагы меристем һәм интернод зурлыгын көйләүдә GAның икеләтә функциясен хуплый. Directionнәлешле күзәнәк бүленеше үрнәге шулай ук эчке SAM тукымасында катгый җайга салынган, һәм бу регламент тамыр үсү өчен бик кирәк52. GA шулай ук эчке SAM оешмасында күзәнәк бүленеше яссылыгын юнәлтүдә роль уйныймы, шуның белән SAM кысаларында интеродларның спецификациясен һәм үсешен синхронлаштыра.
Planсемлекләр туфракта витрода яки 1х Мурашиге-Ског (МС) уртача (Дучефа) 1% сакроза һәм 1% агар (Сигма) белән тулыландырылган, стандарт шартларда (16 с яктылык, 22 ° C), гипокотил һәм тамыр үсү тәҗрибәләреннән кала, үсентеләр даими яктылык һәм 22 ° C. Нитрат экспериментлары өчен үсемлекләр үзгәртелгән MS уртада (bioWORLD үсемлек уртача) җитәрлек селитралар (0 яки 10 мм KNO3), 0,5 мм NH4-суксинат, 1% сакроза һәм 1% А-агар (Сигма) белән тулыландырылган.
PDONR221 эченә кертелгән GID1a cDNA pDONR P4-P1R-pUBQ10 һәм pDONR P2R-P3-mCherry белән pB7m34GW эчендә pUBQ10 :: GID1a-mCherry белән рекомбинацияләнде. PDONR221 эченә кертелгән IDD2 ДНК p35S чыгару өчен pB7RWG266 рекомбинацияләнде: IDD2-RFP. PGID1b :: 2xmTQ2-GID1b чыгару өчен, GID1b кодлау өлкәсенең югары агымындагы 3,9 кб фрагмент һәм GID1b cDNA (1,3 кб) һәм терминатор (3,4 кб) булган 4,7 кб фрагмент башта өстәмә таблицада праймериз ярдәмендә көчәйтелде, аннары pDONR P4R P2R-P3 (Термо Фишер Фәнни), һәм, ниһаять, pDONR221 2xmTQ268 белән рекомбинацияләнде, pGreen 012567 максатлы векторына Gateway клонировкасы ярдәмендә. PCUC2 :: LSSmOrange булдыру өчен, CUC2 промоутер эзлеклелеге (АТГның 3229 ат көченә), аннан соң N7 атом локализациясе сигналы һәм NOS транскрипция терминаторы pGreen канамицинга юнәлтелгән векторга (Gateway 3-фрагмент рекомбинациясе) векторына җыелды. Plantсемлек бинар векторы GV3101 Агробактериум tumefaciens штаммына кертелде һәм Никотиана бентхамиана яфракларына Агробактерий инфилтрация ысулы белән һәм чәчәк ату ысулы белән Arabidopsis taliana Col-0 кертелде. pUBQ10 :: qmRGA pUBQ10 :: GID1a-mCherry һәм pCLV3 :: mCherry-NLS qmRGA тиешенчә крестларның F3 һәм F1 токымнарыннан аерылды.
Ситу гибридизациясендә РНК якынча 1 см озынлыктагы ату киңәшләрендә башкарылды, алар җыелган һәм шунда ук FAA эремәсендә (3,7% формальдегид, 5% кисотик кислотасы, 50% этанол) 4 ° C кадәр суытылган. 2 × 15 мин вакуум белән эшкәртелгәннән соң, фиксиватор үзгәртелде һәм үрнәкләр төнлә инкубацияләнде. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, һәм RGL3 cDNAs һәм аларның 3′-UTR-ларына антисенс зоналары Rosier et al.73 тасвирлаган өстәмә таблицада күрсәтелгән праймериз ярдәмендә синтезланган. Дигоксигенин маркалы зондлар дигоксигенин антителалары ярдәмендә иммунодетацияләнде (3000 тапкыр эретү; Роче, каталог номеры: 11 093 274 910), һәм бүлекләр 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат (BCIP, 250 тапкыр эретү) / нитроблу тетразолий (NB).
Пост вакыты: 10-2025 февраль