Үсентенең апикаль меристемасы (SAM) үсеше сабак архитектурасы өчен бик мөһим. Үсемлек гормоннарыгиббереллиннар(GA) үсемлек үсешен координацияләүдә төп роль уйный, ләкин аларның SAMдагы роле әлегә кадәр аз аңлашылган. Монда без DELLA аксымын GA транскрипция җавабында аның төп көйләү функциясен бастыру өчен проектлаштыру юлы белән GA сигналының коэффициент биосенсорын эшләдек, шул ук вакытта GA тану вакытында аның деградациясен саклап калдык. Без бу деградациягә нигезләнгән биосенсорның GA дәрәҗәләрендәге үзгәрешләрне һәм үсеш вакытында күзәнәк сизүне төгәл теркәвен күрсәтәбез. Без бу биосенсорны SAMда GA сигнал активлыгын картага төшерү өчен кулландык. Без югары GA сигналларының күбесенчә орган примордияләре арасында урнашкан күзәнәкләрдә булуын күрсәтәбез, алар төенара күзәнәкләрнең прекурсорлары. Функцияне арттыру һәм югалту ысулларын кулланып, без GA күзәнәк бүленеш яссылыгының юнәлешен көйли, төенараларның каноник күзәнәк оешмасын булдыра, шуның белән SAMда төенара спецификацияне алга этәрә икәнен күрсәтәбез.
Үсенте очында урнашкан үсенте апикаль меристемасы (САМ) үсемлекнең гомере буе модульле һәм кабатланучы рәвештә ян органнарны һәм сабак төеннәрен барлыкка китерә торган күзәнәкләрнең бер өлешен үз эченә ала. Бу кабатланучы берәмлекләрнең һәрберсе, яки үсемлек төеннәре, төеннәрдәге төеннәр арасындагы һәм ян органнардагы төеннәрне, шулай ук яфрак култыкларындагы култык меристемаларын үз эченә ала1. Үсемлек төеннәренең үсеше һәм оештырылуы үсеш барышында үзгәрә. Arabidopsis'та төеннәр арасындагы үсеш вегетатив этапта баса, һәм култык меристемалары розетка яфраклары култыкларында йокы хәлендә кала. Чәчәк фазасына күчү вакытында САМ чәчәк ату меристемасына әйләнә, озынча төеннәр һәм култык бөреләре, кәбестә яфраклары култыкларындагы ботаклар һәм соңрак яфраксыз чәчәкләр барлыкка китерә2. Яфракларның, чәчәкләрнең һәм ботакларның барлыкка килүен контрольдә тотучы механизмнарны аңлауда без зур уңышларга ирешсәк тә, төеннәр арасындагы үсеш турында чагыштырмача аз билгеле.
GAларның киңлек-вакыт бүленешен аңлау бу гормоннарның төрле тукымаларда һәм төрле үсеш этапларында функцияләрен яхшырак аңларга ярдәм итәчәк. Үз промоутеры тәэсирендә экспрессияләнгән RGA-GFP кушылуының деградациясен визуализацияләү тамырларда гомуми GA дәрәҗәләрен көйләү турында мөһим мәгълүмат бирә15,16. Ләкин RGA экспрессиясе тукымаларда төрлечә17 һәм GA18 белән көйләнә. Шулай итеп, RGA промоутерының дифференциаль экспрессиясе RGA-GFP белән күзәтелгән флуоресценция үрнәгенә китерергә мөмкин, һәм шуңа күрә бу ысул санлы түгел. Күптән түгел биоактив флуоресцеин (Fl) белән билгеләнгән GA19,20 тамыр эндокортексында GA туплануын һәм аның күзәнәк дәрәҗәләренең GA транспорты белән көйләнүен ачыклады. Күптән түгел GA FRET сенсоры nlsGPS1 GA дәрәҗәләренең тамырларда, җепселләрдә һәм караңгы үскән гипокотилларда21 күзәнәк озаюы белән корреляцияләнүен күрсәтте. Шулай да, без күргәнчә, GA концентрациясе GA сигнал активлыгын контрольдә тотучы бердәнбер параметр түгел, чөнки ул катлаулы сизү процессларына бәйле. Монда, DELLA һәм GA сигнал юлларын аңлавыбызга нигезләнеп, без GA сигналы өчен деградациягә нигезләнгән коэффициентлы биосенсорны эшләү һәм характеристикалау турында хәбәр итәбез. Бу санлы биосенсорны эшләү өчен без флуоресцент аксымга кушылган һәм тукымаларда һәркайда экспрессияләнгән мутант GA-сизгер RGA, шулай ук GA-сизгер булмаган флуоресцент аксым кулландык. Без мутант RGA аксым кушылулары һәркайда экспрессияләнгәндә эндоген GA сигналына комачауламый икәнен һәм бу биосенсорның сизү аппараты тарафыннан GA керүе һәм GA сигналын эшкәртү нәтиҗәсендә килеп чыккан сигнал активлыгын югары киңлек-вакыт чишелеше белән санлаштыра алуын күрсәтәбез. Без бу биосенсорны GA сигнал активлыгының киңлек-вакыт бүленешен карталаштыру һәм GAның SAM эпидермисында күзәнәк тәртибен ничек көйләвен санлаштыру өчен кулландык. Без GA органнарның башлангыч органнары арасында урнашкан SAM күзәнәкләренең бүленеш яссылыгы юнәлешен көйли, шуның белән төеннәр арасындагы канон күзәнәк оешмасын билгели икәнен күрсәтәбез.
Ниһаять, без qmRGA эндоген GA дәрәҗәләрендәге үзгәрешләрне үсә торган гипокотиллар ярдәмендә хәбәр итә аламы дип сорадык. Элегрәк без нитратның GA синтезын һәм, үз чиратында, DELLA34 таркалуын арттырып, үсешне стимуллаштыруын күрсәттек. Шуңа күрә, без нитратның мул күләме (10 мМ NO3−) астында үстерелгән pUBQ10::qmRGA үсентеләрендә гипокотил озынлыгы нитрат җитмәгән шартларда үстерелгән үсентеләргә караганда күпкә озынрак булуын күзәттек (Өстәмә 6а рәсем). Үсеш реакциясенә туры китереп, 10 мМ NO3− шартларында үстерелгән үсентеләрнең гипокотилларында GA сигналлары нитрат булмаганда үстерелгән үсентеләргә караганда югарырак булган (Өстәмә 6б, в рәсем). Шулай итеп, qmRGA шулай ук GA концентрациясендәге эндоген үзгәрешләр аркасында килеп чыккан GA сигналларындагы үзгәрешләрне күзәтергә мөмкинлек бирә.
qmRGA тарафыннан ачыкланган GA сигнал активлыгының GA концентрациясенә һәм GA кабул итүенә бәйле булуын аңлау өчен, сенсор конструкциясенә нигезләнеп көтелгәнчә, без вегетатив һәм репродуктив тукымаларда өч GID1 рецепторының экспрессиясен анализладык. Үсентеләрдә GID1-GUS репортер линиясе GID1a һәм c ның котиледоннарда югары экспрессияләнүен күрсәтте (3a–c рәсем). Моннан тыш, өч рецептор да яфракларда, ян тамыр примордияләрендә, тамыр очларында (GID1b тамыр капкачыннан тыш) һәм кан тамырлары системасында экспрессияләнде (3a–c рәсем). Чәчәк чәчәге SAMда без GUS сигналларын бары тик GID1b һәм 1c өчен генә ачыкладык (7a–c өстәмә рәсем). In situ гибридизация бу экспрессия үрнәкләрен раслады һәм GID1c ның SAMда түбән дәрәҗәләрдә бертигез экспрессияләнүен, ә GID1b ның SAM перифериясендә югарырак экспрессия күрсәтүен күрсәтте (7d–l өстәмә рәсем). pGID1b::2xmTQ2-GID1b трансляция кушылуы шулай ук GID1b экспрессиясенең SAM үзәгендә түбән яки бөтенләй булмаганнан алып орган чикләрендә югары экспрессиягә кадәр дәрәҗәле диапазонын күрсәтте (Өстәмә 7m рәсем). Шулай итеп, GID1 рецепторлары тукымаларда һәм алар эчендә тигез бүленмәгән. Киләсе экспериментларда без шулай ук GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) артык экспрессиясенең гипокотилларда тышкы GA куллануга qmRGA сизгерлеген арттыруын күзәттек (3d рәсем, e). Киресенчә, гипокотилда qd17mRGA белән үлчәнгән флуоресценция GA3 эшкәртүгә сизгер булмаган (3f рәсем, g). Ике анализ өчен дә, сенсорның тиз үз-үзен тотышын бәяләү өчен үсентеләр югары концентрацияле GA (100 мкМ GA3) белән эшкәртелде, анда GID1 рецепторына бәйләнеш сәләте көчәйде яки югалды. Бу нәтиҗәләр бергәләп qmRGA биосенсорының GA һәм GA сенсоры буларак берләштерелгән функция башкаруын раслый һәм GID1 рецепторының дифференциаль экспрессиясе сенсорның нурланыш чыгаручанлыгын сизелерлек дәрәҗәдә модуляцияли алуын күрсәтә.
Бүгенге көнгә кадәр SAMда GA сигналларының таралышы ачык түгел. Шуңа күрә без qmRGA экспрессияләүче үсемлекләрне һәм pCLV3::mCherry-NLS күзәнәк репортерын35 кулланып, GA сигнал активлыгының югары ачыклыклы санлы карталарын исәпләдек, L1 катламына (эпидермис; 4a, b рәсемнәр, Методлар һәм Өстәмә Методлар карагыз) игътибар иттек, чөнки L1 SAM үсешен контрольдә тотуда төп роль уйный36. Монда pCLV3::mCherry-NLS экспрессиясе GA сигнал активлыгының киңлек-вакыт бүленешен анализлау өчен билгеләнгән геометрик белешмә ноктасы бирде37. GA ян органнар үсеше өчен мөһим дип саналса да4, без P3 стадиясеннән башлап чәчәк примордиумында (P) GA сигналларының түбән булуын күзәттек (4a, b рәсем), ә яшь P1 һәм P2 примордиумнары үзәк өлкәдәгегә охшаш уртача активлыкка ия иде (4a, b рәсем). Югарырак GA сигнал активлыгы орган примордиум чикләрендә ачыкланды, P1/P2 дән (чикнең яннарында) башланып, P4 тә иң югары ноктасына җитте, шулай ук примордиумнар арасында урнашкан периферик өлкәнең барлык күзәнәкләрендә дә күзәтелде (4a, b рәсем һәм 8a, b өстәмә рәсем). Бу югарырак GA сигнал активлыгы эпидермиста гына түгел, ә L2 һәм өске L3 катламнарында да күзәтелде (Өстәмә 8b рәсем). qmRGA кулланып SAMда ачыкланган GA сигналлары схемасы да вакыт узу белән үзгәрешсез калды (Өстәмә 8c–f рәсем, k). qd17mRGA конструкциясе без җентекләп тасвирлаган биш бәйсез линиядән T3 үсемлекләренең SAMында системалы рәвештә түбәнәйтелсә дә, без pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP конструкциясе белән алынган флуоресценция схемаларын анализлый алдык (Өстәмә 8g–j рәсем, l). Бу контроль сызыгында SAMда флуоресценция коэффициентында кечкенә үзгәрешләр генә ачыкланды, ләкин SAM үзәгендә без TagBFP белән бәйле VENUSның ачык һәм көтелмәгән кимүен күзәттек. Бу qmRGA күзәткән сигнал бирү үрнәгенең mRGA-VENUSның GA-га бәйле деградациясен чагылдыруын раслый, ләкин шулай ук qmRGA меристема үзәгендә GA сигнал бирү активлыгын артык бәяләргә мөмкинлеген күрсәтә. Кыскасы, безнең нәтиҗәләр, нигездә, примордияләрнең таралуын чагылдырган GA сигнал бирү үрнәген күрсәтә. Башлангычлар арасындагы өлкәнең (IPR) бу таралышы үсеп килүче примордий һәм үзәк өлкә арасында югары GA сигнал бирү активлыгының әкренләп урнашуы белән бәйле, шул ук вакытта примордийда GA сигнал бирү активлыгы кими (4c, d рәсемнәр).
GID1b һәм GID1c рецепторларының таралышы (югарыда карагыз) GA рецепторларының дифференциаль экспрессиясе SAMда GA сигнал активлыгы үрнәген формалаштырырга ярдәм итә дип фаразлый. Без GAның дифференциаль туплануы катнашырга мөмкинме дип уйладык. Бу мөмкинлекне тикшерү өчен без nlsGPS1 GA FRET сенсорын21 кулландык. 100 минут дәвамында 10 мкМ GA4+7 белән эшкәртелгән nlsGPS1 SAMда активлаштыру ешлыгы артуы ачыкланды (Өстәмә 9a–e рәсем), бу nlsGPS1ның SAMда GA концентрациясе үзгәрешләренә, тамырларда21 кебек үк, җавап бирүен күрсәтә. nlsGPS1 активлаштыру ешлыгының киңлек буенча таралышы SAMның тышкы катламнарында чагыштырмача түбән GA дәрәҗәләрен күрсәтте, ләкин аларның үзәгендә һәм SAM чикләрендә күтәрелгәнлеген күрсәтте (4e рәсем һәм 9a,c өстәмә рәсем). Бу GAның SAMда да qmRGA белән ачыкланган киңлек үрнәге белән таралганлыгын күрсәтә. Өстәмә ысул буларак, без SAMны флуоресцент GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) яки тискәре контроль буларак Fl белән генә эшкәрттек. Fl сигналы SAM буйлап, шул исәптән үзәк өлкә һәм примордий буйлап таралган, ләкин түбәнрәк интенсивлыкта (4j рәсем һәм 10d өстәмә рәсем). Киресенчә, өч GA-Fl да примордий чикләрендә һәм IPRның калган өлешендә төрле дәрәҗәдә тупланып, GA7-Fl IPRның иң зур өлкәсендә тупланып калган (4k рәсем һәм 10a,b өстәмә рәсемнәр). Флуоресценция интенсивлыгын санлаштыру GA-Fl белән эшкәртелгән SAMда IPRның IPR булмаган интенсивлыкка нисбәтенең Fl белән эшкәртелгән SAMга караганда югарырак булуын күрсәтте (4l рәсем һәм 10c өстәмә рәсем). Бергәләп, бу нәтиҗәләр GAның орган чигенә иң якын урнашкан IPR күзәнәкләрендә югарырак концентрациядә булуын күрсәтә. Бу SAM GA сигнал активлыгы үрнәгенең GA рецепторларының дифференциаль экспрессиясеннән дә, орган чикләре янындагы IPR күзәнәкләрендә GA дифференциаль туплануыннан да килеп чыгачагын күрсәтә. Шулай итеп, безнең анализ GA сигналының көтелмәгән киңлек-вакыт үрнәген ачыклады, SAM үзәгендә һәм примордиумында активлык түбәнрәк, ә периферик өлкәдә IPRда югарырак активлык күзәтелә.
SAMда дифференциаль GA сигнал активлыгының ролен аңлау өчен, без SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS реаль вакыт режимындагы сурәтләү ярдәмендә GA сигнал активлыгы, күзәнәк киңәюе һәм күзәнәк бүленеше арасындагы корреляцияне анализладык. Үсешне көйләүдә GA ролен исәпкә алып, күзәнәк киңәю параметрлары белән уңай корреляция көтелә иде. Шуңа күрә без башта GA сигнал активлыгы карталарын күзәнәк өслеге үсеш тизлеге карталары белән (бирелгән күзәнәк өчен һәм бүленештәге кыз күзәнәкләр өчен күзәнәк киңәю көченең проксисы буларак) һәм күзәнәк киңәюенең юнәлешен үлчәүче үсеш анизотропиясе карталары белән чагыштырдык (монда билгеле бер күзәнәк өчен һәм бүленештәге кыз күзәнәкләр өчен дә кулланыла; 5a,b рәсемнәр, Методлар һәм Өстәмә Методларны карагыз). SAM күзәнәк өслеге үсеш тизлеге карталарыбыз алдагы күзәтүләр белән туры килә38,39, чиктә минималь үсеш темплары һәм үсештәге чәчәкләрдә максималь үсеш темплары белән (5a рәсем). Төп компонент анализы (PCA) GA сигнал активлыгы күзәнәк өслеге үсеш интенсивлыгы белән тискәре корреляциядә булуын күрсәтте (5c рәсем). Шулай ук без вариациянең төп күчәрләренең, шул исәптән GA сигнал керүе һәм үсеш интенсивлыгының, югары CLV3 экспрессиясе белән билгеләнгән юнәлешкә ортогональ булуын күрсәттек, бу калган анализларда SAM үзәгеннән күзәнәкләрнең чыгарылуын раслады. Спирман корреляциясе анализы PCA нәтиҗәләрен раслады (5d рәсем), бу IPRдагы югарырак GA сигналлары күзәнәк киңәюенә китермәвен күрсәтә. Ләкин, корреляция анализы GA сигнал активлыгы һәм үсеш анизотропиясе арасында бераз уңай корреляцияне күрсәтте (5c, d рәсем), бу IPRдагы югарырак GA сигналы күзәнәк үсеш юнәлешенә һәм, мөгаен, күзәнәк бүленеш яссылыгы позициясенә йогынты ясавын күрсәтә.
a, b SAM'да уртача өслек үсешенең (a) һәм үсеш анизотропиясенең (b) җылылык карталары җиде бәйсез үсемлек буенча уртача исәпләнде (күзәнәк киңәюенең көче һәм юнәлеше өчен прокси буларак кулланыла). c PCA анализы түбәндәге үзгәрүчәннәрне үз эченә алды: GA сигналы, өслек үсеше интенсивлыгы, өслек үсеше анизотропиясе һәм CLV3 экспрессиясе. PCA компоненты 1, нигездә, өслек үсеше интенсивлыгы белән тискәре корреляцияләнгән һәм GA сигналы белән уңай корреляцияләнгән. PCA компоненты 2, нигездә, өслек үсеше анизотропиясе белән уңай корреляцияләнгән һәм CLV3 экспрессиясе белән тискәре корреляцияләнгән. Процентлар һәр компонент белән аңлатылган үзгәрүчәнлекне күрсәтә. d CZ'ны исәпкә алмаганда, тукыма масштабында GA сигналы, өслек үсеше интенсивлыгы һәм өслек үсеше анизотропиясе арасындагы Спирман корреляция анализы. Уң яктагы сан - ике үзгәрүчән арасындагы Спирман rho кыйммәте. Йолдызчыклар корреляция/тискәре корреляция бик мөһим булган очракларны күрсәтә. e Col-0 SAM L1 күзәнәкләренең конфокаль микроскопия ярдәмендә 3D визуализациясе. 10 сәгатьтә SAMда (ләкин примордийда түгел) барлыкка килгән яңа күзәнәк тышчалары почмак кыйммәтләренә карап төсләнә. Төс сызыгы аскы уң почмакта күрсәтелгән. Кертмәдә 0 сәгатьтә тиешле 3D рәсем күрсәтелгән. Эксперимент ике тапкыр кабатланды, охшаш нәтиҗәләр белән. f Тартма графиклары IPR һәм IPR булмаган Col-0 SAMда (n = 10 бәйсез үсемлек) күзәнәк бүленү тизлеген күрсәтә. Үзәк сызык медиананы күрсәтә, ә тартма чикләре 25 нче һәм 75 нче процентильләрне күрсәтә. Мыеклар R программасы белән билгеләнгән минималь һәм максималь кыйммәтләрне күрсәтә. P кыйммәтләре Уэлчның ике койрыклы t-тест ярдәмендә алынган. g, h Схематик диаграмма (g) яңа күзәнәк тышчасының (алсу төс) почмагын SAM үзәгеннән радиаль юнәлешкә карата ничек үлчәргә икәнен күрсәтә (ак нокталы сызык) (кискен почмак кыйммәтләре генә исәпкә алына, ягъни 0–90°), һәм (h) меристема эчендәге әйләнә/ян һәм радиаль юнәлешләр. i SAM (кара зәңгәр), IPR (уртача зәңгәр) һәм IPR булмаган (ачык зәңгәр) буенча күзәнәк бүленеше яссылыгы ориентациясенең ешлык гистограммалары. P кыйммәтләре ике койрыклы Колмогоров-Смирнов тесты ярдәмендә алынган. Тәҗрибә ике тапкыр кабатланган, охшаш нәтиҗәләр белән. j IPRның P3 (ачык яшел), P4 (уртача яшел) һәм P5 (кара яшел) тирәсендәге күзәнәк бүленеше яссылыгы ориентациясенең ешлык гистограммалары. P кыйммәтләре ике койрыклы Колмогоров-Смирнов тесты ярдәмендә алынган. Тәҗрибә ике тапкыр кабатланган, охшаш нәтиҗәләр белән.
Шуңа күрә, без анализ вакытында яңа барлыкка килгән күзәнәк тышчаларын ачыклап, GA сигнализациясе һәм күзәнәк бүленеше активлыгы арасындагы корреляцияне тикшердек (5e рәсем). Бу ысул безгә күзәнәк бүленеше ешлыгын һәм юнәлешен үлчәргә мөмкинлек бирде. Гаҗәпләнерлек, без IPR һәм SAMның калган өлешендә (IPR булмаган, 5f рәсем) күзәнәк бүленеше ешлыгы охшаш булуын ачыкладык, бу IPR һәм IPR булмаган күзәнәкләр арасындагы GA сигнализациясендәге аермаларның күзәнәк бүленешенә сизелерлек йогынты ясамавын күрсәтә. Бу һәм GA сигнализациясе һәм үсеш анизотропиясе арасындагы уңай корреляция безне GA сигнализация активлыгы күзәнәк бүленеше яссылыгының юнәлешенә тәэсир итә алу-алмавын карарга этәрде. Без яңа күзәнәк тышчасының юнәлешен меристема үзәген һәм яңа күзәнәк тышчасының үзәген тоташтыручы радиаль күчәренә карата кискен почмак буларак үлчәдек (5e-i рәсем) һәм күзәнәкләрнең радиаль күчәренә карата 90° га якын почмакларда бүленү тенденциясен ачык күзәттек, иң югары ешлыклар 70–80° (23,28%) һәм 80–90° (22,62%) (5e,i рәсем) күзәтелде, бу күзәнәкнең әйләнә/киңәйтелгән юнәлештә бүленүенә туры килә (5h рәсем). Бу күзәнәк бүленүенә GA сигнализациясенең өлешен тикшерү өчен, без IPR һәм IPR булмаган күзәнәк бүленү параметрларын аерым анализладык (5i рәсем). Без IPR күзәнәкләрендәге бүленеш почмагы бүленешенең IPR булмаган күзәнәкләрдәге яки SAMның бөтен күзәнәкләрендәгедән аерылып торуын күзәттек, IPR күзәнәкләре ян/түгәрәк күзәнәк бүленешләренең югарырак өлешен күрсәтә, ягъни 70–80° һәм 80–90° (тиешле рәвештә 33,86% һәм 30,71%) (5i рәсем). Шулай итеп, безнең күзәтүләр югары GA сигнализациясе һәм күзәнәк бүленеш яссылыгы ориентациясе арасында бәйләнеш барлыгын күрсәтте, бу GA сигнализация активлыгы һәм үсеш анизотропиясе арасындагы корреляциягә охшаш (5c, d рәсемнәр). Бу бәйләнешнең киңлек сакланышын тагын да ачыклау өчен, без примордиумны уратып алган IPR күзәнәкләрендәге бүленеш яссылыгы ориентациясен P3 тан башлап үлчәдек, чөнки бу өлкәдә P4 тан башлап иң югары GA сигнализация активлыгы ачыкланды (4 нче рәсем). IPRның P3 һәм P4 тирәсендәге бүленеш почмаклары статистик яктан әһәмиятле аермалар күрсәтмәде, гәрчә P4 тирәсендәге IPRда ян күзәнәк бүленешләренең ешлыгы артуы күзәтелде (5j рәсем). Шулай да, P5 тирәсендәге IPR күзәнәкләрендә күзәнәк бүленеше яссылыгы ориентациясендәге аерма статистик яктан әһәмиятле булды, аркылы күзәнәк бүленеше ешлыгы кискен артты (5j рәсем). Бергәләп, бу нәтиҗәләр GA сигнализациясенең SAMда күзәнәк бүленеше ориентациясен контрольдә тота алуын күрсәтә, бу югары GA сигнализациясенең IPRда күзәнәк бүленешенең янга ориентациясен китереп чыгара алуы турындагы элеккеге хәбәрләр белән туры килә40,41.
IPRдагы күзәнәкләрнең примордияләргә түгел, ә төеннәр арасында урнашачагы фаразлана2,42,43. IPRдагы күзәнәк бүленешләренең аркылы юнәлеше төеннәр арасында эпидермис күзәнәкләренең параллель буйлы рәтләренең типик оешуда барлыкка килергә мөмкин. Югарыда тасвирланган күзәтүләребез GA сигнализациясенең күзәнәк бүленеше юнәлешен көйләү юлы белән бу процесста роль уйнавын күрсәтә.
Берничә DELLA генының функциясен югалту конститутив GA җавабына китерә, һәм бу гипотезаны тикшерү өчен делла мутантлары кулланылырга мөмкин44. Башта без SAMда биш DELLA генының экспрессия үрнәкләрен анализладык. GUS линиясенең45 транскрипция кушылмасы GAI, RGA, RGL1 һәм RGL2 (күпкә азрак дәрәҗәдә) SAMда экспрессияләнгәнен күрсәтте (Өстәмә 11a–d рәсем). In situ гибридизациясе GAI мРНКсының, аерым алганда, примордияләрдә һәм үсеп килүче чәчәкләрдә туплануын күрсәтте (Өстәмә 11e рәсем). RGL1 һәм RGL3 мРНКсы SAM яфраклары буйлап һәм өлкәнрәк чәчәкләрдә ачыкланды, ә RGL2 мРНКсы чик буенда күбрәк иде (Өстәмә 11f–h рәсем). pRGL3::RGL3-GFP SAM конфокаль сурәтләү in situ гибридизациясе белән күзәтелгән экспрессияне раслады һәм RGL3 аксымының SAMның үзәк өлешендә туплануын күрсәтте (Өстәмә 11i рәсем). pRGA::GFP-RGA линиясен кулланып, без шулай ук RGA аксымының SAMда туплануын ачыкладык, ләкин аның күләме P4 дан башлап чиктә кими (Өстәмә 11j рәсем). Шунысы игътибарга лаек, RGL3 һәм RGA экспрессия үрнәкләре qmRGA тарафыннан ачыкланганча, IPRда югарырак GA сигнал активлыгы белән туры килә (4 нче рәсем). Моннан тыш, бу мәгълүматлар барлык DELLAларның SAMда чагылыш табуын һәм аларның экспрессиясе бергәләп бөтен SAMны үз эченә алуын күрсәтә.
Аннары без кыргый типтагы SAM (Ler, контроль) һәм gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della бишлекле (глобаль) мутантларындагы күзәнәк бүленеш параметрларын анализладык (6а, б рәсем). Кызыклысы шунда ки, без della глобаль мутант SAMда кыргый тип белән чагыштырганда күзәнәк бүленеш почмаклары ешлыклары бүленешендә статистик яктан әһәмиятле үзгәреш күзәттек (6в рәсем). della глобаль мутантындагы бу үзгәреш 80–90° почмаклар ешлыгының артуы (34,71% vs. 24,55%) һәм, азрак дәрәҗәдә, 70–80° почмаклар (23,78% vs. 20,18%) ешлыгы арту белән бәйле, ягъни аркылы күзәнәк бүленешләренә туры килә (6в рәсем). Күләгә булмаган бүленешләр ешлыгы (0–60°) della глобаль мутантында да түбәнрәк булган (6в рәсем). della глобаль мутантының SAMында аркылы күзәнәк бүленешләренең ешлыгы сизелерлек арткан (6б рәсем). IPRдагы аркылы күзәнәк бүленешләренең ешлыгы della глобаль мутантында кыргый тип белән чагыштырганда югарырак булган (6d рәсем). IPR өлкәсеннән тыш, кыргый типта күзәнәк бүленеш почмаклары тигезрәк бүленгән, ә della глобаль мутант IPR кебек тангенциаль бүленешләрне өстен күргән (6e рәсем). Шулай ук, без GA туплана торган GA-актив булмаган мутант фонында ga2 оксидаза (ga2ox) бишлек мутантларының (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 һәм ga2ox6-2) SAMында күзәнәк бүленешләренең юнәлешен санлаштырдык. GA дәрәҗәләренең артуына туры китереп, биш ga2ox мутант чәчәк атуының SAMы Col-0ныкыннан зуррак булган (Өстәмә 12a рәсем, b), һәм Col-0 белән чагыштырганда, биш ga2ox SAM күзәнәк бүленү почмакларының ачык аерылып торуын күрсәтте, почмак ешлыгы 50° тан 90° ка кадәр артты, ягъни тагын бер тапкыр тангенциаль бүленүләргә өстенлек бирде (Өстәмә 12a–c рәсем). Шулай итеп, без GA сигнализациясенең һәм GA туплануының конститутив активлашуы IPRда һәм SAMның калган өлешендә латераль күзәнәк бүленүләрен китереп чыгаруын күрсәтәбез.
a, b Конфокаль микроскопия ярдәмендә PI белән буялган Ler (a) һәм глобаль делла мутант (b) SAMның L1 катламының 3D визуализациясе. 10 сәгатьлек чорда SAMда (ләкин примордийда түгел) барлыкка килгән яңа күзәнәк стеналары күрсәтелгән һәм аларның почмак кыйммәтләренә карап буялган. Кертмәдә 0 сәгатьтәге SAM күрсәтелгән. Төс сызыгы аскы уң почмакта күрсәтелгән. (b) сызыгындагы ук глобаль делла мутантындагы тигезләнгән күзәнәк файллары мисалына күрсәтә. Тәҗрибә охшаш нәтиҗәләр белән ике тапкыр кабатланды. ce Ler һәм глобаль делла арасында бөтен SAM (d), IPR (e) һәм IPR булмаган (f) күзәнәк бүленеш яссылыгы ориентацияләренең ешлык бүленешен чагыштыру. P кыйммәтләре ике койрыклы Колмогоров-Смирнов тесты ярдәмендә алынган. f, g Col-0 (i) һәм pCUC2::gai-1-VENUS (j) трансген үсемлекләренең PI белән буялган SAMының конфокаль рәсемнәренең 3D визуализациясе. (a, b) панельләрендә 10 сәгать эчендә SAMда барлыкка килгән яңа күзәнәк тышчалары (ләкин примордияләр түгел) күрсәтелгән. Тәҗрибә охшаш нәтиҗәләр белән ике тапкыр кабатланган. h–j Col-0 һәм pCUC2::gai-1-VENUS үсемлекләре арасында SAM (h), IPR (i) һәм IPR булмаган (j) бөтенлегендә урнашкан күзәнәк бүленеш яссылыгы ориентацияләренең ешлык бүленешен чагыштыру. P кыйммәтләре ике койрыклы Колмогоров-Смирнов тесты ярдәмендә алынган.
Аннары без GA сигналын тоткарлауның йогынтысын, аерым алганда, IPRда сынап карадык. Моның өчен без VENUS белән кушылган доминант тискәре gai-1 аксымының экспрессиясен стимуллаштыру өчен котиледон чынаяк 2 (CUC2) промоторын кулландык (pCUC2::gai-1-VENUS линиясендә). Кыргый типтагы SAMда CUC2 промоторы P4 тан башлап SAMдагы күпчелек IPRларның, шул исәптән чик күзәнәкләренең экспрессиясен стимуллаштыра, һәм pCUC2::gai-1-VENUS үсемлекләрендә дә шундый ук специфик экспрессия күзәтелде (түбәндә карагыз). pCUC2::gai-1-VENUS үсемлекләренең SAM яки IPR буенча күзәнәк бүленеш почмакларының таралышы кыргый типтагыдан сизелерлек аерылмады, гәрчә көтелмәгәнчә, без бу үсемлекләрдә IPR булмаган күзәнәкләрнең 80–90° югарырак ешлыкта бүленгәнен ачыкладык (6f–j рәсем).
Күзәнәк бүленеше юнәлеше SAM геометриясенә, аеруча тукыма кәкрелеге тудырган тарту көчәнешенә бәйле дип фаразлана46. Шуңа күрә без della global мутантында һәм pCUC2::gai-1-VENUS үсемлекләрендә SAM формасы үзгәргәнме дип сорадык. Элегрәк хәбәр ителгәнчә12, della global мутант SAM зурлыгы кыргый типтагыдан зуррак булган (Өстәмә 13a, b, d рәсем). CLV3 һәм STM RNA-ның in situ гибридизациясе della мутантларында меристема киңәюен раслады һәм күзәнәк нишасының янга киңәюен күрсәтте (Өстәмә 13e, f, h, i рәсем). Ләкин, SAM кәкрелеге ике генотипта да охшаш булган (Өстәмә 13k, m, n, p рәсем). Без gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple мутантында да шундый ук зурлык артуын күзәттек, кыргый тип белән чагыштырганда кәкрелек үзгәрмәде (Өстәмә 13c, d, g, j, l, o, p). Күзәнәк бүленеше ориентациясе ешлыгы della quadruple мутантында да тәэсир итте, ләкин della monolitic мутантына караганда азрак дәрәҗәдә (Өстәмә 12d–f рәсем). Бу доза эффекты, кәкрелеккә йогынты ясамау белән бергә, Della quadruple мутантындагы калдык RGL3 активлыгы DELLA активлыгы югалуы аркасында күзәнәк бүленеше ориентациясендәге үзгәрешләрне чикли һәм латераль күзәнәк бүленешләрендәге үзгәрешләр SAM геометриясендәге үзгәрешләргә түгел, ә GA сигнал активлыгындагы үзгәрешләргә җавап итеп барлыкка килә дип күрсәтә. Югарыда тасвирланганча, CUC2 промоторы SAMда IPR экспрессиясен P4 тан башлап этәрә (Өстәмә 14a, b рәсем), һәм киресенчә, pCUC2::gai-1-VENUS SAM киметелгән зурлыкта, ләкин югарырак кәкрелектә булган (Өстәмә 14c–h рәсем). pCUC2::gai-1-VENUS SAM морфологиясендәге бу үзгәреш механик көчәнешләрнең кыргый тип белән чагыштырганда башкача таралуына китерергә мөмкин, анда югары әйләнә көчәнешләре SAM үзәгеннән кыскарак ераклыкта башлана47. Икенче яктан, pCUC2::gai-1-VENUS SAM морфологиясендәге үзгәрешләр трансген экспрессиясе белән индукцияләнгән төбәк механик үзлекләрендәге үзгәрешләр нәтиҗәсендә килеп чыгарга мөмкин48. Ике очракта да, бу күзәнәкләрнең әйләнә/күндәлә юнәлештә бүленү ихтималын арттыру юлы белән GA сигнализациясендәге үзгәрешләрнең йогынтысын өлешчә компенсацияләргә мөмкин, бу безнең күзәтүләребезне аңлата.
Бергәләп караганда, безнең мәгълүматлар югарырак GA сигнализациясенең IPRда күзәнәк бүленеше яссылыгының янга таба ориентациясендә актив роль уйнавын раслый. Алар шулай ук меристема кәкрелегенең IPRда күзәнәк бүленеше яссылыгының ориентациясенә дә йогынты ясавын күрсәтә.
IPRдагы бүленеш яссылыгының аркылы юнәлеше, югары GA сигнал активлыгы аркасында, GA эпидермис эчендә радиаль күзәнәк файлын алдан оештыра, соңрак эпидермис ара төенендә табылачак күзәнәк оешмасын билгели. Чыннан да, мондый күзәнәк файллары della global мутантларының SAM рәсемнәрендә еш күренә иде (6б рәсем). Шулай итеп, SAMда GA сигнал бирүнең киңлек үрнәгенең үсеш функциясен тагын да тирәнрәк өйрәнү өчен, без кыргый типтагы (Ler һәм Col-0), della global мутантларында һәм pCUC2::gai-1-VENUS трансген үсемлекләрендә IPRдагы күзәнәкләрнең киңлек оешмасын анализлау өчен вакыт аралыгы сурәтләү ысулын кулландык.
Без qmRGA'ның IPR'дагы GA сигнал активлыгы P1/P2'дан артуын һәм P4'та иң югары ноктасына җитүен күрсәткәнен ачыкладык, һәм бу үрнәк вакыт узу белән даими булып калды (4a–f рәсем һәм 8c–f, k өстәмә рәсем). GA сигналы арту белән IPR'дагы күзәнәкләрнең киңлек оешмасын анализлау өчен, без Ler IPR күзәнәкләрен P4'ның өстендә һәм яннарында беренче күзәтүдән соң 34 сәгатьтән соң анализланган үсеш язмышына карап билгеләдек, ягъни ике пластидтан артык вакыт, бу безгә P1/P2'дан P4'ка кадәр башлангыч үсеш вакытында IPR күзәнәкләрен күзәтергә мөмкинлек бирде. Без өч төрле төс кулландык: P4 янындагы башлангычка интеграцияләнгән күзәнәкләр өчен сары, IPR'да булганнар өчен яшел һәм ике процесста да катнашканнар өчен шәмәхә төс (7a–c рәсем). t0'да (0 сәгать), P4 алдында 1-2 IPR күзәнәк катламы күренә иде (7a рәсем). Көтелгәнчә, бу күзәнәкләр бүленгәндә, алар моны, нигездә, аркылы бүленеш яссылыгы аша эшләделәр (7a–c рәсемнәр). Шундый ук нәтиҗәләр Col-0 SAM ярдәмендә алынган (P3кә игътибар итеп, аның чиге Lerда P4кә охшаш рәвештә бөкләнә), гәрчә бу генотипта чәчәк чигендә барлыкка килгән бөкләнеш IPR күзәнәкләрен тизрәк яшергән булса да (7g–i рәсем). Шулай итеп, IPR күзәнәкләренең бүленү схемасы күзәнәкләрне, төенаралардагы кебек, радиаль рәтләргә алдан оештыра. Радиаль рәтләрнең оешуы һәм IPR күзәнәкләренең чиратлашкан органнар арасында урнашуы бу күзәнәкләрнең төенара башлангыч булуын күрсәтә.
Монда без GA һәм GA рецепторларының берләштерелгән концентрацияләреннән килеп чыккан GA сигнал активлыгын санлы карталаштыру мөмкинлеген бирә торган, шул ук вакытта эндоген сигнал юлларына комачаулауны минимальләштерә торган, шуның белән күзәнәк дәрәҗәсендә GA функциясе турында мәгълүмат бирә торган нисбәт-метрик GA сигнал биосенсорын, qmRGA, эшләдек. Моның өчен без DELLA үзара бәйләнеш партнерларын бәйләү сәләтен югалткан, ләкин GA тарафыннан китереп чыгарылган протеолизга сизгер булып калган модификацияләнгән DELLA аксымын, mRGA, төзедек. qmRGA GA дәрәҗәләрендәге экзоген һәм эндоген үзгәрешләргә җавап бирә, һәм аның динамик сизү үзенчәлекләре үсеш вакытында GA сигнал активлыгындагы киңлек-вакыт үзгәрешләрен бәяләргә мөмкинлек бирә. qmRGA шулай ук бик сыгылмалы корал, чөнки аны экспрессияләү өчен кулланылган промоторны үзгәртеп (кирәк булса) төрле тукымаларга җайлаштырырга мөмкин, һәм GA сигнал юлының сакланган табигатен һәм ангиоспермнардагы PFYRE мотивын исәпкә алып, аны башка төрләргә күчереп була22. Моңа туры китереп, дөге SLR1 DELLA аксымындагы (HYY497AAA) эквивалент мутация дә SLR1 үсеш репрессор активлыгын бастыруы, шул ук вакытта аның GA аша деградациясен бераз гына киметүе күрсәтелде, mRGA23 кебек. Шунысы игътибарга лаек, Arabidopsis'тагы соңгы тикшеренүләр PFYRE доменындагы (S474L) бер аминокислота мутациясе RGA'ның транскрипция активлыгын үзгәртүен күрсәтте, аның транскрипция факторы партнерлары50 белән үзара бәйләнешкә керү сәләтенә тәэсир итмичә. Бу мутация mRGA'да булган 3 аминокислота алмаштыруына бик якын булса да, безнең тикшеренүләр бу ике мутациянең DELLA'ның аерым үзенчәлекләрен үзгәртүен күрсәтә. Транскрипция факторы партнерларының күбесе DELLA26,51'нең LHR1 һәм SAW доменнарына бәйләнсә дә, PFYRE доменындагы кайбер сакланган аминокислоталар бу үзара бәйләнешләрне тотрыклыландырырга ярдәм итә ала.
Төеннәр арасындагы үсеш үсемлек архитектурасында һәм уңышны арттыруда төп билге булып тора. qmRGA IPR төеннәр арасындагы башлангыч күзәнәкләрендә югарырак GA сигнал активлыгын күрсәтте. Санлы сурәтләү һәм генетиканы берләштереп, без GA сигнал үрнәкләренең SAM эпидермисында түгәрәк/күзәнәк бүленеш яссылыкларын каплавын күрсәттек, бу төеннәр арасындагы үсеш өчен кирәкле күзәнәк бүленеше оешмасын формалаштыра. Үсеш барышында күзәнәк бүленеше яссылыгы юнәлешенең берничә регуляторы ачыкланды52,53. Безнең эш GA сигнал активлыгының бу күзәнәк параметрын ничек көйләвенә ачык мисал китерә. DELLA алдан бөкләнүче аксым комплекслары белән үзара бәйләнештә була41, шуңа күрә GA сигналы кортикаль микротүтүкчәләр юнәлешенә турыдан-туры йогынты ясап, күзәнәк бүленеше яссылыгы юнәлешен көйли ала40,41,54,55. Без көтелмәгәнчә SAMда югарырак GA сигнал активлыгы корреляциясе күзәнәк сузылуы яки бүленүе түгел, ә үсеш анизотропиясе генә булуын күрсәттек, бу GAның IPRда күзәнәк бүленеше юнәлешенә турыдан-туры йогынтысы белән туры килә. Ләкин, бу эффектның туры булмаган булырга мөмкинлеген дә кире кага алмыйбыз, мәсәлән, GA тарафыннан индукцияләнгән күзәнәк тышчасы йомшаруы56 белән арадашчылык ителә56. Күзәнәк тышчасы үзенчәлекләрендәге үзгәрешләр механик көчәнеш китереп чыгара57,58, бу шулай ук кортикаль микротүтүкчәләрнең юнәлешенә тәэсир итеп, күзәнәк бүленеш яссылыгының юнәлешенә тәэсир итә ала39,46,59. GA тарафыннан китереп чыгарылган механик көчәнешнең һәм GA тарафыннан микротүтүкчәләр юнәлешенең турыдан-туры көйләнешенең берләштерелгән йогынтысы төеннәр арасын билгеләү өчен IPRда күзәнәк бүленеш юнәлешенең билгеле бер үрнәген булдыруда катнашырга мөмкин, һәм бу идеяне тикшерү өчен өстәмә тикшеренүләр кирәк. Шулай ук, алдагы тикшеренүләр төеннәр арасын формалаштыруны контрольдә тотуда DELLA белән үзара бәйләнештә булган TCP14 һәм 15 аксымнарының мөһимлеген күрсәтте60,61, һәм бу факторлар төеннәр арасын үстерүне көйләүче BREVIPEDICELLUS (BP) һәм PENNYWISE (PNY) белән бергә GA эшчәнлегендә арадашчылык итә ала2,62. DELL-лар брассиностероид, этилен, ясмон кислотасы һәм абсциз кислотасы (ABA) сигнал юллары белән үзара бәйләнештә булуын исәпкә алганда63,64 һәм бу гормоннар микротөтүкчәләр ориентациясенә65 тәэсир итә алуын исәпкә алганда, GA-ның күзәнәк бүленеше ориентациясенә йогынтысы башка гормоннар белән дә бәйле булырга мөмкин.
Иртә цитологик тикшеренүләр күрсәткәнчә, Arabidopsis SAM-ның эчке һәм тышкы өлкәләре төенара үсеш өчен кирәк2,42. GA эчке тукымаларда күзәнәк бүленешен актив рәвештә көйләве12, SAM-да меристема һәм төенара зурлыкны көйләүдә GA-ның икеләтә функциясен хуплый. Юнәлешле күзәнәк бүленеше схемасы шулай ук эчке SAM тукымасында нык көйләнгән, һәм бу көйләү сабак үсеше өчен бик мөһим52. GA-ның эчке SAM оешмасында күзәнәк бүленеше яссылыгын ориентлаштыруда да роль уйнавын, шуның белән SAM эчендә төенараларның спецификациясен һәм үсешен синхронлаштыруын тикшерү кызыклы булачак.
Үсемлекләр туфракта яки 1% сахароза һәм 1% агар (Sigma) белән тулыландырылган 1x Мурашиге-Скуг (MS) мохитендә (Duchefa) стандарт шартларда (16 сәгать яктылыкта, 22 °C) үстерелде, гипокотил һәм тамыр үсеше экспериментларыннан тыш, үсентеләр даими яктылыкта һәм 22 °C температурада вертикаль пластиналарда үстерелде. Нитрат экспериментлары өчен үсемлекләр озын көн шартларында җитәрлек нитрат (0 яки 10 мМ KNO3), 0,5 мМ NH4-сукцинат, 1% сахароза һәм 1% А-агар (Sigma) белән тулыландырылган модификацияләнгән MS мохитендә (bioWORLD үсемлек мохитендә) үстерелде.
pDONR221 эченә кертелгән GID1a кДНКсы pDONR P4-P1R-pUBQ10 һәм pDONR P2R-P3-mCherry белән pB7m34GW эченә pUBQ10::GID1a-mCherry барлыкка китерү өчен рекомбинацияләнде. pDONR221 эченә кертелгән IDD2 ДНКсы p35S:IDD2-RFP барлыкка китерү өчен pB7RWG266 эченә рекомбинацияләнде. pGID1b::2xmTQ2-GID1b генерацияләү өчен, GID1b кодлау өлкәсеннән югарырак урнашкан 3,9 кб фрагмент һәм GID1b кДНКсын (1,3 кб) һәм терминаторны (3,4 кб) үз эченә алган 4,7 кб фрагмент башта 3 нче өстәмә таблицадагы праймерлар ярдәмендә көчәйтелде, аннары pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) һәм pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) эченә кертелде, һәм ниһаять, Gateway клонлаштыру ярдәмендә pDONR221 2xmTQ268 белән pGreen 012567 максат векторына рекомбинацияләнде. pCUC2::LSSmOrange генерацияләү өчен, CUC2 промотор эзлеклелеге (ATG агымы буенча 3229 bp өскә), аннары N7 ядро локализациясе сигналы һәм NOS транскрипция терминаторы белән зур Стокс-шифтланган mOrange (LSSmOrange)69 кодлау эзлеклелеге Gateway 3-фрагмент рекомбинация системасы (Invitrogen) ярдәмендә pGreen канамицин максатчан векторына җыелды. Үсемлекнең икелекле векторы Agrobacterium tumefaciens GV3101 штаммына кертелде һәм Nicotiana benthamiana яфракларына Agrobacterium инфильтрация ысулы белән һәм Arabidopsis thaliana Col-0 га чәчәк ману ысулы белән кертелде. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry һәм pCLV3::mCherry-NLS qmRGA тиешле кисешмәләрнең F3 һәм F1 токымнарыннан аерылды.
РНК in situ гибридизациясе якынча 1 см озынлыктагы үсенте очларында башкарылды72, алар җыелды һәм шунда ук 4 °C кадәр суытылган FAA эремәсендә (3,7% формальдегид, 5% сиркә кислотасы, 50% этанол) фиксацияләнде. 2 × 15 минутлык вакуум эшкәртүдән соң, фиксатор алыштырылды һәм үрнәкләр төнлә инкубацияләнде. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 һәм RGL3 кДНКлары һәм антисенс зондлары аларның 3′-UTRларына Розьер һ.б.73 тарафыннан тасвирланганча, 3 нче өстәмә таблицада күрсәтелгән праймерлар ярдәмендә синтезланды. Дигоксигенин белән билгеләнгән зондлар дигоксигенин антитәнчекләре ярдәмендә иммунодетификацияләнде (3000 тапкыр суюлту; Roche, каталог номеры: 11 093 274 910), һәм кисемтәләр 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP, 250 тапкыр суюлту)/нитрозәңгәр тетразолий (NBT, 200 тапкыр суюлту) эремәсе белән буялды.
Бастырып чыгару вакыты: 2025 елның 10 феврале