Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт. Сез куллана торган браузер версиясендә CSS ярдәме чикләнгән. Иң яхшы нәтиҗәләргә ирешү өчен, без сезгә браузерыгызның яңарак версиясен кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'да туры килүчәнлек режимын сүндерегез). Шуңа кадәр, даими ярдәм күрсәтү өчен, без сайтны стильләштермичә яки JavaScriptсыз күрсәтәбез.
Табигый продуктларны ачу һәм файдалы куллану кеше тормышын яхшыртырга ярдәм итә ала. Үсемлекләрнең үсешен тоткарлаучы химик матдәләр чүп үләннәрен контрольдә тоту өчен гербицидлар буларак киң кулланыла. Төрле гербицидлар куллану зарурлыгы аркасында, яңа тәэсир итү механизмнары булган кушылмаларны ачыклау зарурлыгы туа. Бу тикшеренүдә без Streptomyces werraensis MK493-CF1'дән яңа N-алкоксипиррол кушылмасын, кумамонамидны ачтык һәм тулы синтез процессын билгеләдек. Биологик активлык анализлары ярдәмендә без урс-моноамид кислотасының урс-моноамидның синтетик арадаш матдәсе һәм потенциальүсемлек үсеше ингибиторыМоннан тыш, без төрле урбенон кислотасы туындыларын эшләдек, шул исәптән HeLa күзәнәкләре үсешенә тискәре йогынты ясамыйча, югары гербицид активлыгына ия булган урбенилокси туындысын (UDA) да. Без шулай ук урмотон кислотасы туындыларының үсемлек микротөтүкчәләрен бозуын ачыкладык; өстәвенә, KAND актин җепселләренә тәэсир итә һәм күзәнәк үлеменә китерә; Бу күпкырлы эффектлар билгеле микротөтүкчәләр ингибиторларыннан аерылып тора һәм урсон кислотасы өчен яңа тәэсир механизмын тәкъдим итә, бу яңа гербицидлар эшләүдә мөһим өстенлек булып тора.
Файдалы табигый продуктларны һәм аларның чыгарылмаларын ачу һәм гамәли куллану кеше тормышы сыйфатын яхшырту чарасы булып тора. Микроорганизмнар, үсемлекләр һәм бөҗәкләр тарафыннан җитештерелгән икенчел метаболитлар медицинада һәм авыл хуҗалыгында зур казанышларга китерде. Табигый продуктлардан күп антибиотиклар һәм лейкемиягә каршы препаратлар эшләнгән. Моннан тыш, төрле төрләрпестицидлар, фунгицидлар һәм гербицидлар бу табигый продуктлардан авыл хуҗалыгында куллану өчен алына. Аерым алганда, чүп үләннәренә каршы гербицидлар заманча авыл хуҗалыгында уңышны арттыру өчен мөһим корал булып тора, һәм төрле кушылмалар инде коммерция максатларында кулланыла. Үсемлекләрдәге берничә күзәнәк процессы, мәсәлән, фотосинтез, аминокислоталар метаболизмы, күзәнәк тышчасы синтезы, митозны көйләү, фитогормон сигнализациясе яки аксым синтезы, гербицидларның типик максатлары булып санала. Микротүтүкчәләр функциясен тоткарлаучы кушылмалар - митоз көйләүгә тәэсир итеп, үсемлекләрнең үсешенә тәэсир итүче гербицидларның киң таралган классы2.
Микротүтүкчәләр цитоскелетның компонентлары булып тора һәм эукариот күзәнәкләрендә киң саклана. Тубулин гетеродимере α-тубулин һәм β-тубулиннан тора, алар сызыклы микротүтүкчәләр протофиламентларын барлыкка китерә, ә 13 протофиламент цилиндрик структура барлыкка китерә. Микротүтүкчәләр үсемлек күзәнәкләрендә күп роль уйный, шул исәптән күзәнәк формасын, күзәнәк бүленешен һәм күзәнәк эчендәге транспортны билгели3,4. Үсемлек күзәнәкләрендә фазаара плазма мембранасы астында микротүтүкчәләр бар, һәм бу кортикаль микротүтүкчәләр дип аталганнар целлюлоза синтаза комплексларын көйләү аша целлюлоза микрофибриллалар оешмасын контрольдә тота дип санала4,5. Тамыр очының тиз сузылу зонасында булган тамыр эпидермис күзәнәкләренең кортикаль микротүтүкчәләре ян якта урнашкан, һәм целлюлоза микрофибриллалар бу микротүтүкчәләр артыннан бара һәм күзәнәк киңәю юнәлешен чикли, шуның белән анизотроп күзәнәк сузылуын стимуллаштыра. Шуңа күрә микротүтүкчәләр функциясе үсемлек морфологиясе белән тыгыз бәйләнгән. Тубулинны кодлаучы геннардагы аминокислота алмашулары кортикаль микротүтүк массивларының бозылуына һәм Arabidopsis 6,7 да сул яки уң яклы үсешкә китерә. Шулай ук, микротүтүк динамикасын көйләүче микротүтүкләр белән бәйле аксымнардагы мутацияләр дә тамыр үсешенең бозылуына китерергә мөмкин8,9,10,11,12,13. Моннан тыш, микротүтүкләрне бозучы гербицидлар, мәсәлән, дисопирамид, претилахлор дип тә атала, белән эшкәртү дә сул яклы кыек тамыр үсешен китереп чыгара14. Бу мәгълүматлар микротүтүкләр функциясен төгәл көйләү үсемлек үсеше юнәлешен билгеләү өчен бик мөһим икәнен күрсәтә.
Микротүтүкчәләр ингибиторларының төрле төрләре ачылган, һәм бу препаратлар цитоскелет тикшеренүләренә, шулай ук авыл хуҗалыгына һәм медицинага зур өлеш керткән2. Аерым алганда, оризалин, динитроанилин кушылмалары, дизопирамид, бензамид белән бәйле кушылмалар һәм аларның аналоглары микротүтүкчәләр функциясен тоткарлый һәм шуның белән үсемлекләрнең үсешен тоткарлый ала. Шуңа күрә алар гербицидлар буларак киң кулланыла. Ләкин, микротүтүкчәләр үсемлек һәм хайван күзәнәкләренең мөһим компоненты булганлыктан, күпчелек микротүтүкчәләр ингибиторлары ике күзәнәк төре өчен дә цитотоксик. Шуңа күрә, гербицидлар буларак танылган файдалы булуларына карамастан, гамәли максатларда чикләнгән санда антимикротүтүк препаратлары кулланыла.
Streptomyces - Streptomyces гаиләсенең бер ыруы, ул аэроб, грам-позитив, җепсыман бактерияләрне үз эченә ала һәм киң диапазонлы икенчел метаболитлар җитештерү сәләте белән киң билгеле. Шуңа күрә ул яңа биологик актив табигый продуктларның иң мөһим чыганакларының берсе дип санала. Хәзерге тикшеренүдә без кумамонамид дип аталган яңа кушылманы ачтык, ул Streptomyces werraensis MK493-CF1 һәм S. werraensis ISP 5486 дан аерылган. Спектраль анализ һәм тулы спектраль анализ ярдәмендә кумамонамидның структурасы характерланды һәм аның уникаль N-алкоксипиррол скелетының синтезы билгеләнде. Урсмон кислотасы, урсмонамид һәм аның туындыларының синтетик арадаш продукты, популяр модель үсемлеге Arabidopsis thaliana үсемлегенең үсешен һәм шытуын тоткарлый дип табылды. Структура-активлык бәйләнешен өйрәнүдә без урсон кислотасына үзгәртелгән C9 белән кушылманың, урсон кислотасының нонилоксиды туындысы (KAND) дип атала, үсешкә һәм шытуга тоткарлаучы йогынтысын сизелерлек көчәйтә икәнен ачыкладык. Шунысы игътибарга лаек, яңа ачылган үсемлек үсеше ингибиторы тәмәке һәм бавыр үләне үсешенә дә тәэсир иткән һәм бактерияләргә яки HeLa күзәнәкләренә цитотоксик булмаган. Моннан тыш, кайбер урмотон кислотасы туындылары тамыр фенотипын бозып күрсәтә, бу туындыларның микротөшмәләргә турыдан-туры яки туры булмаган йогынты ясавын күрсәтә. Бу фикергә туры китереп, иммуногистохимик яки флуоресцент аксымнар белән билгеләнгән микротөшмәләрне күзәтүебез KAND белән дәвалауның микротөшмәләрне деполимерлаштыруын күрсәтә. Моннан тыш, кумамотон кислотасы туындылары белән дәвалау актин микрофиламентларын бозган. Шулай итеп, без цитоскелетның җимерелүен үз эченә алган уникаль тәэсир итү механизмы булган яңа үсемлек үсеше ингибиторын ачтык.
Токионың Шинагава-ку шәһәрендә туфрактан MK493-CF1 штаммы аерылды. MK493-CF1 штаммы яхшы тармакланган стромаль мицелий барлыкка китергән. 16S рибосомаль РНК генының өлешчә эзлеклелеге (1422 bp) билгеләнде. Бу штамм S. werraensisка бик охшаш (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: типик штамм, 99,93%). Бу нәтиҗәгә нигезләнеп, бу штаммның S. werraensis тибындагы штаммга тыгыз бәйле булуы ачыкланды. Шуңа күрә без бу штаммны вакытлыча S. werraensis MK493-CF1 дип атадык. S. werraensis ISP 5486T да шул ук биоактив кушылмалар җитештерә. Бу микроорганизмнан табигый продуктлар алу буенча башлангыч тикшеренүләр аз булганлыктан, алга таба химик тикшеренүләр үткәрелде. S. werraensis MK493-CF1 арпа мохитендә 30°C температурада 14 көн дәвамында каты хәлдә ферментация ярдәмендә үстерелгәннән соң, мохит 50% EtOH белән экстракцияләнде. 59,5 мг чи экстракт алу өчен 60 мл үрнәк киптерелде. Чи экстракт N-метокси-1H-пиррол-2-карбоксамид (1, кумамонамид дип атала, 36,0 мг) алу өчен кире фазалы HPLCга дучар ителде. 1 гомуми күләме чи экстрактның якынча 60% тәшкил итә. Шуңа күрә без кумамотоамид 1 үзлекләрен җентекләп өйрәнергә булдык.
Кумамонамид 1 - ак аморф порошок һәм югары ачыклыклы масса-спектрометрия (HRESIMS) C6H8N2O2 раслый (1 нче рәсем). Бу кушылманың C2 белән алыштырылган пиррол фрагменты δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Гц, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H ЯМР спектрында: 4.5 Гц, H-5) һәм δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Гц, H-6) белән характерлана, ә 13C ЯМР спектрында дүрт sp2 углерод атомы барлыгы күрсәтелә. C2 позициясендә амид төркеменең булуы δC 161.1 температурада C-3 протоныннан амид карбонил углеродына HMBC корреляциясе ярдәмендә бәяләнде. Моннан тыш, δH 4.10 (3H, S) һәм δC 68.3 температураларында 1 H һәм 13C ЯМР пиклары молекулада N-метокси төркемнәре булуын күрсәтә. Метокси төркеменең дөрес урнашуы әле спектроскопик анализ, мәсәлән, көчәйтелгән аерма спектроскопиясе һәм нуклеар Оверхаузер кыскартуы (NOEDF) ярдәмендә билгеләнмәгән булса да, N-метокси-1H-пиррол-2-карбоксамид беренче кандидат кушылма булды.
1нең дөрес структурасын билгеләү өчен, тулы синтез үткәрелде (2а рәсем). Сатуда кулланыла торган 2-аминопиридин 2не m-CPBA белән эшкәртү нәтиҗәсендә санлы чыгышта тиешле N-оксид 3 килеп чыкты. 2нең 2-аминоазидлашуыннан соң, Абрамович тасвирлаган циклоконденсация реакциясе бензолда 90°C температурада үткәрелде, теләгән 1-гидрокси-1H-пиррол-2-карбонитрил 5 граммда алынды. Тизлек 60% (ике этап). 15,16. Аннары 4нең метиллашуы һәм гидролизы яхшы чыгышлы 1-метокси-1H-пиррол-2-карбон кислотасын ("кумотоник кислота" дип атала, 6) бирде (70%, ике этап). Ниһаять, сулы аммиак кулланып, кислота хлориды арадаш 6 аша амидлаштыру 98% чыгышлы Кумамото амиды 1 бирде. Синтезланган 1нең барлык спектраль мәгълүматлары изоляцияләнгән 1гә охшаш иде, шуңа күрә 1нең структурасы билгеләнде;
Урбенамид һәм урбен кислотасының биологик активлыгының гомуми синтезы һәм анализы. (а) Кумамото амидының тулы синтезы. (б) Җиде көнлек кыргый типтагы Arabidopsis Columbia (Col) үсентеләре күрсәтелгән концентрацияләрдә кумамонамид 6 яки кумамонамид 1 булган Мурашиге һәм Скуг (MS) тәлинкәләрендә үстерелде. Шкала сызыгы = 1 см.
Башта без урбенамид һәм аның арадаш продуктларының үсемлек үсешен модуляцияләү сәләтен бәяләдек. Без MS агар мохитенә төрле концентрациядәге урсмонамид 1 яки урсмон кислотасы 6 өстәдек һәм бу мохиттә Arabidopsis thaliana үсентеләрен үстердек. Бу анализлар 6ның югары концентрацияләре (500 мкМ) тамыр үсешен тоткарлавын күрсәтте (2б рәсем). Аннары без 6ның N1 позициясен куеп төрле чыгарылмаларны алдык һәм аларда структура-активлык бәйләнешләрен өйрәндек (аналог синтез процессы өстәмә мәгълүматта (SI) тасвирланган). Arabidopsis үсентеләре 50 мкМ урсон кислотасы чыгарылмаларын үз эченә алган мохиттә үстерелде, һәм тамыр озынлыгы үлчәнде, рәсемдә күрсәтелгәнчә. 3a, b һәм S1 рәсемнәрендә күрсәтелгәнчә, кумамо кислоталарының N1 позициясендә төрле озынлыктагы сызыклы алкокси чылбырлары (9, 10, 11, 12 һәм 13) яки зур алкокси чылбырлары (15, 16 һәм 17) бар. Төрле матдәләр тамыр үсешен сизелерлек тоткарлаган. Моннан тыш, без 200 мкМ 10, 11 яки 17 куллануның шытуны тоткарлавын ачыкладык (3в һәм S2 рәсемнәре).
Кумамото амидының һәм аңа бәйле кушылмаларның структура-активлык бәйләнешен өйрәнү. (а) Аналогларның структурасы һәм синтез схемасы. (б) 50 мкМ кумамонамид туындылары белән яки ансыз MS мохитендә үстерелгән 7 көнлек үсентеләрнең тамыр озынлыгын санлаштыру. Йолдызчыклар ялган эшкәртү белән мөһим аермаларны күрсәтә (t-тест, p<0.05). n>18. Мәгълүматлар уртача ± SD буларак күрсәтелгән. nt "сыналмаган" дигәнне аңлата, чөнки орлыкларның 50% тан артыгы шытып чыкмаган. (c) MS мохитендә 7 көн дәвамында 200 мкМ кумамонамид һәм аңа бәйле кушылмалар белән яки кушылмасыз инкубацияләнгән эшкәртелгән орлыкларның шытып чыгу тизлеген санлаштыру. Йолдызчыклар ясалма эшкәртү белән мөһим аермаларны күрсәтә (хи-квадрат тесты). n=96.
Кызыклысы шунда ки, C9 дан озынрак алкил ян чылбырлар өстәү ингибитор активлыгын киметкән, бу кумамотой кислотасы белән бәйле кушылмаларның биологик активлыгын күрсәтү өчен билгеле бер зурлыктагы ян чылбырлар кирәклеген күрсәтә.
Структура-активлык бәйләнеше анализы C9 урсон кислотасына үзгәртелгәнен һәм урсон кислотасының нонилокси туындысы (алга таба KAND 11 дип атала) үсемлек үсешенең иң нәтиҗәле ингибиторы булуын күрсәткәнлектән, без KAND 11нең җентеклерәк характеристикасын үткәрдек. Arabidopsisны 50 мкМ KAND 11 белән эшкәртү шытуны тулысынча диярлек тоткарлады, ә KAND 11нең түбән концентрацияләре (40, 30, 20 яки 10 мкМ) тамыр үсешен дозага бәйле рәвештә тоткарлады (4а, б рәсем). KAND 11 тамыр меристемасының яшәүчәнлегенә тәэсир итүен тикшерү өчен, без пропидий йодиды (PI) белән буялган тамыр меристемаларын тикшердек һәм меристема мәйданы зурлыгын үлчәдек. 25 мкМ KAND-11 булган мохиттә үстерелгән үсентеләрнең меристемасының зурлыгы 151,1 ± 32,5 мкм тәшкил иткән, ә DMSO булган контроль мохиттә үстерелгән үсентеләрнең меристемасының зурлыгы 264,7 ± 30,8 мкм тәшкил иткән (4c, d рәсемнәр), бу KAND-11 күзәнәк активлыгын торгыза дигәнне аңлата. таралу. Тамыр меристемасы. Моңа туры китереп, KAND 11 белән эшкәртү тамыр меристемасында күзәнәк бүленеше маркеры CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS сигналы күләмен киметкән (4e рәсем) 17. Бу нәтиҗәләр KAND 11 күзәнәк пролиферациясе активлыгын киметү юлы белән тамыр үсешен тоткарлавын күрсәтә.
Урбенон кислотасы туындыларының (урбенилокси туындылары) үсешкә тоткарлаучы йогынтысын анализлау. (а) KAND 11 концентрацияләре күрсәтелгән MS пластиналарында үстерелгән 7 көнлек кыргый типтагы Col үсентеләре. Масштаблы сызык = 1 см. (б) Тамыр озынлыгын санлаштыру. Хәрефләр мөһим аермаларны күрсәтә (Tukey HSD тесты, p<0.05). n>16. Мәгълүматлар уртача ± SD буларак күрсәтелгән. (c) 25 мкМ KAND белән яки ансыз MS пластиналарында үстерелгән пропидий йодид белән буялган кыргый типтагы Col тамырларының конфокаль микроскопиясе. 11. Ак җәяләр тамыр меристемасын күрсәтә. Масштаб сызыгы = 100 мкм. (d) Тамыр меристемасы зурлыгын санлаштыру (n = 10 нан 11 гә кадәр). Статистик аермалар t-тест ярдәмендә билгеләнде (p< 0,05). Баганалар меристеманың уртача зурлыгын күрсәтә. (e) CDKB2 конструкциясен үз эченә алган тамыр меристемасының дифференциаль интерференция контрасты (DIC) микроскопиясе; 1pro: CDKB2; 1-GUS MS пластиналарында үстерелгән 5 көнлек үсентеләргә 25 µM KAND анализы белән яки ансыз буялган һәм буялган.
KAND 11 фитотоксиклыгы тагын бер ике яруслы үсемлек - тәмәке (Nicotiana tabacum) һәм төп җир үсемлеге моделе организмы - бавыр үләне (Marchantia polymorpha) ярдәмендә тикшерелде. Arabidopsis очрагындагы кебек, 25 мкМ KAND 11 булган мохиттә үстерелгән тәмәке SR-1 үсентеләре кыскарак тамырлар бирде (5а рәсем). Моннан тыш, 48 орлыкның 40ы 200 мкМ KAND 11 булган тәлинкәләрдә шытты, ә барлык 48 орлык та эшкәртелгән мохиттә шытты, бу KANDның югарырак концентрацияләренең әһәмиятле булуын күрсәтә (p< 0,05; чи тесты - квадрат) тәмәке шытуын тоткарлады. (5б рәсем). Моннан тыш, бавыр үләнендә бактерияләр үсешен тоткарлаган KAND 11 концентрациясе Arabidopsis'тагы нәтиҗәле концентрациягә охшаш иде (5в рәсем). Бу нәтиҗәләр KAND 11 төрле үсемлекләрнең үсешен тоткарлый алуын күрсәтә. Аннары без башка организмнарда, атап әйткәндә, кеше HeLa күзәнәкләрендә һәм Escherichia coli штаммы DH5α штаммында аю моноамидына бәйле кушылмаларның цитотоксик булуын тикшердек, алар югарырак хайван һәм бактерия күзәнәкләренең вәкилләре буларак. Берничә күзәнәк пролиферациясе анализларында без кумамонамид 1, кумамонамид кислотасы 6 һәм KAND 11 100 мкМ концентрациядә HeLa яки E. coli күзәнәкләренең үсешенә тәэсир итмәвен күзәттек (5d,e рәсем).
Arabidopsis булмаган организмнарда KAND 11 үсешен тоткарлау. (а) Ике атналык кыргый типтагы SR-1 тәмәке үсентеләре 25 мкМ KAND 11 булган вертикаль урнаштырылган MS пластиналарында үстерелде. (б) Ике атналык кыргый типтагы SR-1 тәмәке үсентеләре 200 мкМ KAND 11 булган горизонталь урнаштырылган MS пластиналарында үстерелде. (в) Gamborg B5 пластиналарында күрсәтелгән KAND 11 концентрацияләре белән үстерелгән ике атналык кыргый типтагы Tak-1 бавыр кортлары бөреләре. Кызыл уклар ике атналык инкубация чорында үсүдән туктаган споралар күрсәтә. (г) HeLa күзәнәкләренең күзәнәк пролиферациясе анализы. Яшәүчән күзәнәкләр саны 8 нче күзәнәк санау комплекты (Dojindo) ярдәмендә билгеләнгән вакыт аралыгында үлчәнде. Контроль буларак, HeLa күзәнәкләре 5 мкг/мл актиномицин D (D акт) белән эшкәртелде, ул РНК полимераза транскрипциясен тоткарлый һәм күзәнәк үлеменә китерә. Анализлар өч тапкыр башкарылды. (д) E. coli күзәнәк пролиферациясе анализы. E. coli үсеше OD600 үлчәү юлы белән анализланды. Контроль буларак, күзәнәкләргә бактерия күзәнәк тышчасы синтезын тоткарлаучы 50 мкг/мл ампициллин (Amp) бирелде. Анализлар өч тапкыр башкарылды.
Урамид белән бәйле кушылмалар китереп чыгарган цитотоксиклыкның тәэсир итү механизмын аңлау өчен, без уртача тоткарлаучы йогынтысы булган урбен кислотасы туындыларын яңадан анализладык, бу рәсемдә күрсәтелгәнчә. 2b, 6a рәсемнәрендә күрсәтелгәнчә, югары концентрацияле (200 мкМ) урмотон кислотасы 6 булган агар пластинкаларында үстерелгән үсентеләр кыскарак һәм сулга бөгелгән тамырлар бирде (θ = – 23,7 ± 6,1), ә контроль мохиттә үстерелгән үсентеләр туры тамырлар бирде (θ = – 3,8 ± 7,1). Бу характерлы кыек үсеш кортикаль микротөтүкчәләрнең дисфункциясе нәтиҗәсендә килеп чыга дип билгеле14,18. Бу ачышка туры китереп, микротөтүкчәләрне тотрыксызландыручы дисопирамид һәм оризалин препаратлары безнең үсеш шартларында охшаш тамыр авышуын китереп чыгарды (2b, 6a рәсемнәр). Шул ук вакытта, без урмотон кислотасы туындыларын сынап карадык һәм билгеле бер концентрацияләрдә кыек тамыр үсешен китереп чыгарган берничәсен сайладык. 8, 9 һәм 15 нче кушылмалар 75 мкМ, 50 мкМ һәм 40 мкМ тамыр үсеш юнәлешен үзгәртте, бу бу кушылмаларның микротөшмәләрне нәтиҗәле рәвештә тотрыксызландыра алуын күрсәтә (2б, 6а рәсемнәр). Без шулай ук иң көчле урсол кислотасы туындысы KAND 11не түбәнрәк концентрациядә (15 мкМ) сынап карадык һәм KAND 11 куллану тамыр үсешен тоткарлавын һәм тамыр үсеш юнәлешенең тигез булмавын ачыкладык, гәрчә алар сулга авышса да (C3 рәсем). Микротөшмәләрне тотрыксызландыручы препаратларның югарырак концентрацияләре кайвакыт тамырның авышуына китермичә, үсемлек үсешен тоткарлаганга күрә, без KAND 11нең тамыр эпидермис күзәнәкләрендә кортикаль микротөшмәләрне күзәтеп, микротөшмәләргә тәэсир итү мөмкинлеген бәяләдек. 25 мкМ KAND 11 белән эшкәртелгән үсенте тамырларының эпидермис күзәнәкләрендә анти-β-тубулин антитәнчекләрен кулланып иммуногистохимия сузылу зонасындагы эпидермис күзәнәкләрендә барлык кортикаль микротүтүкчәләрнең диярлек юкка чыгуын күрсәтте (6б рәсем). Бу нәтиҗәләр кумамотон кислотасы һәм аның туындылары микротүтүкчәләргә турыдан-туры яки туры булмаган рәвештә тәэсир итеп, аларны боза һәм бу кушылмалар яңа микротүтүкчә ингибиторлары булуын күрсәтә.
Урсон кислотасы һәм аның туендырмалары Arabidopsis thaliana кортикаль микротүтүкчәләрен үзгәртә. (а) Күрсәтелгән концентрацияләрдә төрле урмотон кислотасы туендырмалары булганда үлчәнгән тамыр авышлыгы почмагы. Микротүтүкчәләрне тоткарлаучы ике кушылманың: дизопирамид һәм оризалинның йогынтысы да анализланды. Өстәмәдә тамыр үсеш почмагын үлчәү өчен кулланылган стандарт күрсәтелгән. Йолдызчыклар ялган дәвалау белән мөһим аермаларны күрсәтә (t-тест, p<0.05). n>19. Шкала сызыгы = 1 см. (b) Озынлык зонасындагы эпидермис күзәнәкләрендәге кортикаль микротүтүкчәләр. 25 мкМ KAND 11 белән яки ансыз MS пластиналарында үстерелгән кыргый типтагы Arabidopsis Col тамырларындагы микротүтүкчәләр β-тубулин беренчел антитәнчекләре һәм Alexa Fluor белән конъюгацияләнгән икенчел антитәнчекләр ярдәмендә иммуногистохимик буяу ярдәмендә күрсәтелде. Шкала сызыгы = 10 мкм. (c) Тамыр меристемасында микротүтүкчәләрнең митотик структурасы. Микротүтүкчәләр иммуногистохимик буяу ярдәмендә күрсәтелде. Профаза зоналары, уемчалар һәм фрагмопластларны үз эченә алган митотик структуралар конфокаль рәсемнәрдән саналды. Уклар митотик микротүтүкчә структураларын күрсәтә. Йолдызчыклар ялган дәвалау белән мөһим аермаларны күрсәтә (t-тест, p<0.05). n>9. Масштаб сызыгы = 50 мкм.
Ursa микротүтүкчәләр функциясен бозарга сәләтле булса да, аның тәэсир итү механизмы гадәти микротүтүкчәләр деполимеризацияләүче агентлардан аерылып торачак дип көтелә. Мәсәлән, дисопирамид һәм оризалин кебек микротүтүкчәләр деполимеризацияләүче агентларның югарырак концентрацияләре эпидермис күзәнәкләренең анизотроп киңәюенә китерә, ә KAND 11 китерми. Моннан тыш, KAND 11 һәм дисопирамидны бергә куллану дисопирамид китереп чыгарган тамыр үсешенә җавап бирде һәм KAND 11 китереп чыгарган үсеш тоткарлануы күзәтелде (S4 рәсем). Без шулай ук гиперсизгер дисопирамид 1-1 (phs1-1) мутантының KAND 11гә җавабын анализладык. phs1-1 канон булмаган тубулин киназа ноктасы мутациясенә ия һәм дисопирамид9,20 белән эшкәрткәндә кыскарак тамырлар чыгара. KAND 11 булган агар мохитендә үстерелгән phs1-1 мутант үсентеләренең тамырлары дисопирамидта үстерелгәннәргә охшаш кыскарак иде (S5 рәсем).
Моннан тыш, без KAND 11 белән эшкәртелгән үсентеләрнең тамыр меристемасында профаза зоналары, уемнар һәм фрагмопластлар кебек митотик микротүтүкчәләр структураларын күзәттек. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS өчен күзәтүләргә туры китереп, митотик микротүтүкчәләр санының сизелерлек кимүе күзәтелде (6в рәсем).
KAND 11 цитотоксиклыгын субклеткалы чишелештә характерлау өчен, без тәмәке BY-2 суспензия күзәнәкләрен KAND 11 белән эшкәрттек һәм аларның реакциясен күзәттек. Башта без микротүтүкчәләргә KAND 11 йогынтысын бәяләү өчен микротүтүкчәләрне флуоресцент рәвештә билгеләүче TagRFP-TUA6 экспрессияләүче BY-2 күзәнәкләренә KAND 11 өстәдек. Кортикаль микротүтүкчәләр тыгызлыгы цитоплазматик пиксельләр арасында цитоскелет пиксельләренең процентын санлаштырган рәсем анализы ярдәмендә бәяләнде. Анализ нәтиҗәләре күрсәткәнчә, 50 мкМ яки 100 мкМ KAND 11 белән 1 сәгать дәвамында эшкәрткәннән соң, тыгызлык сизелерлек дәрәҗәдә 0,94 ± 0,74% яки 0,23 ± 0,28% ка кадәр кимегән, ә DMSO белән эшкәртелгән күзәнәкләр тыгызлыгы 1,61 ± 0,34% тәшкил иткән (7а рәсем). Бу нәтиҗәләр Arabidopsis'та KAND 11 белән эшкәртү кортикаль микротөшмәләрнең деполимерлашуын китереп чыгаруы күзәтүе белән туры килә (6б рәсем). Шулай ук без шул ук концентрациядәге KAND 11 белән эшкәрткәннән соң GFP-ABD белән билгеләнгән актин җепселләре белән BY-2 линиясен тикшердек һәм KAND 11 белән эшкәртү актин җепселләрен бозуын күзәттек. 50 мкМ яки 100 мкМ KAND 11 белән 1 сәгать эшкәртү актин җепселләренең тыгызлыгын 1,20 ± 0,62% яки 0,61 ± 0,26% кадәр сизелерлек киметте, ә DMSO белән эшкәртелгән күзәнәкләрдәге тыгызлык 1,69 ± 0,51% тәшкил итте (2 нче рәсем). 7б). Бу нәтиҗәләр актин җепселләренә тәэсир итмәгән пропизамид һәм микротөшмәләргә тәэсир итмәгән актин деполимеризаторы латрункулин В йогынтысы белән капма-каршы килә (SI S6 рәсем). Моннан тыш, кумамонамид 1, кумамонамид кислотасы 6 яки KAND 11 белән эшкәртү HeLa күзәнәкләрендәге микротөшчәләргә тәэсир итмәде (SI S7 рәсем). Шулай итеп, KAND 11нең тәэсир итү механизмы билгеле цитоскелет бозучыларыннан аерылып тора дип санала. Моннан тыш, KAND 11 белән эшкәртелгән BY-2 күзәнәкләрен микроскопик күзәтүебез KAND 11 белән эшкәртү вакытында күзәнәк үлеме башлануын күрсәтте һәм Эванс зәңгәр төсле үле күзәнәкләр өлеше KAND 11 белән эшкәртүнең 30 минутыннан соң сизелерлек артмаганын күрсәтте, ә 50 мкМ яки 100 мкМ KAND белән 90 минут эшкәртүдән соң үле күзәнәкләр саны 43,7% яки 80,1% ка кадәр арткан (7в рәсем). Бергәләп караганда, бу мәгълүматлар яңа урсол кислотасы туындысы KAND 11нең элек билгеле булмаган тәэсир итү механизмы белән үсемлеккә хас цитоскелет ингибиторы булуын күрсәтә.
KAND кортикаль микротөшмәләргә, актин җепселләренә һәм тәмәке BY-2 күзәнәкләренең яшәүчәнлегенә тәэсир итә. (а) TagRFP-TUA6 булганда BY-2 күзәнәкләрендә кортикаль микротөшмәләрнең визуализациясе. KAND 11 (50 мкМ яки 100 мкМ) яки DMSO белән эшкәртелгән BY-2 күзәнәкләре конфокаль микроскопия ярдәмендә тикшерелде. Кортикаль микротөшмәләрнең тыгызлыгы 25 бәйсез күзәнәкнең микрографияләреннән исәпләнде. Хәрефләр мөһим аермаларны күрсәтә (Tukey HSD тесты, б.< 0,05). Масштаблы сызык = 10 мкм. (b) GFP-ABD2 катнашында BY-2 күзәнәкләрендәге кортикаль актин җепселләре күрсәтелде. KAND 11 (50 мкМ яки 100 мкМ) яки DMSO белән эшкәртелгән BY-2 күзәнәкләре конфокаль микроскопия ярдәмендә тикшерелде. Кортикаль актин җепселләренең тыгызлыгы 25 бәйсез күзәнәкнең микрографияләреннән исәпләнде. Хәрефләр мөһим аермаларны күрсәтә (Tukey HSD тесты, p< 0,05). Масштаб сызыгы = 10 мкм. (c) Эванс зәңгәр буявы ярдәмендә үлгән BY-2 күзәнәкләрен күзәтү. KAND 11 (50 мкМ яки 100 мкМ) яки DMSO белән эшкәртелгән BY-2 күзәнәкләре якты кырлы микроскопия ярдәмендә тикшерелде. n=3. Масштаб сызыгы = 100 мкм.
Яңа табигый продуктларны ачу һәм куллану кеше тормышының төрле өлкәләрендә, шул исәптән медицина һәм авыл хуҗалыгында да зур алга китешләргә китерде. Табигый ресурслардан файдалы кушылмалар алу өчен тарихи тикшеренүләр үткәрелде. Аерым алганда, актиномицетлар нематодалар өчен паразитларга каршы антибиотиклар буларак файдалы дип санала, чөнки алар төрле икенчел метаболитларны, мәсәлән, ивермектинның алдынгы кушылмасын һәм блеомицин һәм аның туындыларын җитештерү сәләтенә ия, алар медицинада яман шешкә каршы агент буларак кулланыла21,22. Шулай ук, актиномицетлардан төрле гербицид кушылмалары табылган, аларның кайберләре инде коммерция максатларында кулланыла1,23. Шуңа күрә, актиномицет метаболитларын табигый продуктларны аерып алу өчен анализлау нәтиҗәле стратегия дип санала. Бу тикшеренүдә без S. werraensis'тан яңа кушылма, кумамонамид, таптык һәм аны уңышлы синтезладык. Урсон кислотасы - урбенамид һәм аның туындыларының синтетик арадаш продукты. Ул тамырларның үзенчәлекле бөдрәләвенә китерә, уртача яки көчле гербицид активлыгы күрсәтә һәм үсемлек микротөшчәләренә турыдан-туры яки туры булмаган зыян китерә ала. Шулай да, урмотон кислотасының тәэсир итү механизмы гамәлдәге микротүтүкчәләр ингибиторларынкыннан аерылып торырга мөмкин, чөнки KAND 11 шулай ук актин җепселләрен боза һәм күзәнәк үлеменә китерә, бу урмотон кислотасы һәм аның туындыларының цитоскелет структураларының киң диапазонына йогынты ясаучы көйләү механизмын күрсәтә.
Урбенон кислотасының тагын да җентекле характеристикасы урбенон кислотасының тәэсир итү механизмын яхшырак аңларга ярдәм итәчәк. Аерым алганда, киләсе максат - урсон кислотасының редукцияләнгән микротүтүкчәләргә бәйләнү сәләтен бәяләү, урсон кислотасы һәм аның туындылары микротүтүкчәләргә турыдан-туры тәэсир итәме һәм аларны деполимерлаштырамы, яки аларның тәэсире микротүтүкчәләрнең тотрыксызлануына китерәме икәнен билгеләү. Моннан тыш, микротүтүкчәләр турыдан-туры максат булмаган очракта, үсемлек күзәнәкләрендә урсон кислотасының тәэсир итү урынын һәм молекуляр максатларын билгеләү бәйле кушылмаларның үзенчәлекләрен һәм гербицид активлыгын яхшыртуның мөмкин булган юлларын яхшырак аңларга ярдәм итәчәк. Безнең биоактивлык анализы урсон кислотасының Arabidopsis thaliana, тәмәке һәм бавыр үләне кебек үсемлекләрнең үсешенә уникаль цитотоксик сәләтен күрсәтте, шул ук вакытта E. coli да, HeLa күзәнәкләренә дә тәэсир итмәде. Хайван күзәнәкләренә токсик тәэсир итү аз яки бөтенләй юк, чөнки алар ачык авыл хуҗалыгы кырларында куллану өчен гербицидлар буларак эшләнгән. Чыннан да, микротүтүкчәләр эукариотларда киң таралган структуралар булганлыктан, аларның үсемлекләрдә сайлап ингибирлануы гербицидлар өчен төп таләп булып тора. Мәсәлән, тубулинга турыдан-туры бәйләнгән һәм полимерлашуны тоткарлаган микротүтүкчәләрне деполимерлаштыручы агент пропизамид, хайваннар күзәнәкләренә түбән токсиклыгы аркасында гербицид буларак кулланыла24. Дизопирамидтан аермалы буларак, бәйле бензамидларның төрле максатчан спецификасы бар. Үсемлек микротүтүкчәләреннән тыш, RH-4032 яки бензоксамид шулай ук хайваннар күзәнәкләренең яки оомицетларның микротүтүкчәләрен тоткарлый, ә залиламид түбән фитотоксиклыгы аркасында фунгицид буларак кулланыла25,26,27. Яңа ачылган аю һәм аның туындылары үсемлекләргә каршы сайлап цитотоксиклык күрсәтә, ләкин шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, алга таба модификацияләү аларның максатчан спецификасын үзгәртергә мөмкин, бу патоген гөмбәләрне яки оомицетларны контрольдә тоту өчен өстәмә туындылар бирә ала.
Урбенон кислотасы һәм аның туындыларының уникаль үзлекләре аларны гербицидлар буларак үстерү һәм тикшеренү кораллары буларак куллану өчен файдалы. Цитоскелетның үсемлек күзәнәкләренең формасын контрольдә тотудагы әһәмияте киң танылган. Элегрәк үткәрелгән тикшеренүләр үсемлекләрнең морфогенезны тиешенчә контрольдә тоту өчен микротүтүк динамикасын контрольдә тоту юлы белән кортикаль микротүтүкләр оештыруның катлаулы механизмнарын үстерүләрен күрсәтте. Микротүтүкләр активлыгын көйләү өчен җаваплы булган күп санлы молекулалар ачыкланды, һәм бәйле тикшеренүләр әле дә дәвам итә3,4,28. Үсемлек күзәнәкләрендәге микротүтүкләр динамикасы турындагы хәзерге аңлавыбыз кортикаль микротүтүкләр оештыру механизмнарын тулысынча аңлатмый. Мәсәлән, дизопирамид та, оризалин да микротүтүкләрне деполимерлаштыра алса да, дизопирамид тамырларның нык деформациясенә китерә, ә оризалин чагыштырмача җиңел йогынты ясый. Моннан тыш, микротүтүкләрне тотрыклыландыручы тубулиндагы мутацияләр тамырларда декстроротациягә китерә, ә микротүтүкләр динамикасын тотрыклыландыручы паклитаксел юк. Шуңа күрә, урсол кислотасының молекуляр максатларын өйрәнү һәм билгеләү үсемлек кортикаль микротүтүкчәләрен көйләүгә яңа карашлар бирергә тиеш. Шулай ук, дисопирамид кебек бозылган үсешне стимуллаштыруда нәтиҗәле булган химик матдәләрне һәм оризалин яки кумамотор кислотасы кебек эффектив булмаган химик матдәләрне киләчәктә чагыштыру бозылган үсешнең ничек баруын ачыкларга ярдәм итәчәк.
Икенче яктан, саклану белән бәйле цитоскелет үзгәрешләре урсон кислотасының цитотоксиклыгын аңлатуның тагын бер мөмкинлеге булып тора. Патогенның инфекциясе яки үсемлек күзәнәкләренә элиситор кертү кайвакыт цитоскелетның җимерелүенә һәм аннан соң күзәнәк үлеменә китерә29. Мәсәлән, оомицетлардан алынган криптоксантинның тәмәке күзәнәкләренең үлеменә кадәр микротүтүкчәләрне һәм актин җепселләрен бозуы турында хәбәр ителгән, бу KAND белән дәвалау вакытында булган хәлгә охшаш30,31. Саклану җаваплары һәм урсон кислотасы белән китереп чыгарылган күзәнәк җаваплары арасындагы охшашлыклар безне аларның гадәти күзәнәк процессларын башлап җибәрүе турында фаразларга этәрде, гәрчә урсон кислотасының криптоксантинга караганда тизрәк һәм көчлерәк тәэсире ачык күренсә дә. Ләкин, тикшеренүләр актин җепселләренең бозылуы күзәнәкнең үзеннән-үзе үлеменә китерә икәнен күрсәтте, бу һәрвакыт микротүтүкчәләрнең бозылуы белән бергә булмый29. Моннан тыш, урсон кислотасы туындылары кебек, патоген яки элиситор тамыр үсешенең бозылуына китерәме, әлегә билгесез. Шулай итеп, саклану җавапларын һәм цитоскелетны бәйләүче молекуляр белем - хәл ителергә тиешле җәлеп итүчән проблема. Урсон кислотасы белән бәйле түбән молекуляр авырлыктагы кушылмаларның, шулай ук төрле потенциаллы туындыларның булуын файдаланып, алар билгесез күзәнәк механизмнарын максат итеп кую мөмкинлекләрен бирә ала.
Бергәләп караганда, микротүтүкчәләр динамикасын модуляцияләүче яңа кушылмаларны ачу һәм куллану үсемлек күзәнәкләренең формасын билгеләүнең катлаулы молекуляр механизмнарын тикшерү өчен көчле ысуллар бирәчәк. Бу контекстта, микротүтүкчәләргә һәм актин җепселләренә тәэсир итүче һәм күзәнәк үлеменә китерә торган яңа эшләнгән урмотон кислотасы кушылмасы микротүтүкчәләр контроле һәм бу башка механизмнар арасындагы бәйләнешне ачыкларга мөмкинлек бирә ала. Шулай итеп, урбенон кислотасын кулланып химик һәм биологик анализ безгә үсемлек цитоскелетын контрольдә тотучы молекуляр көйләү механизмнарын аңларга ярдәм итәчәк.
S. werraensis MK493-CF1 препаратын 500 мл Эрленмейер колбасына 2% (w/v) галактоза, 2% (w/v) эссенция пастасыннан, 1% (w/v) Bacto составыннан торган 110 мл орлык мохите салынган 500 мл күләмле Эрленмейер колбасына салыгыз. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) кукуруз экстракты (KOGOSTCH Co., Ltd., Япония), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 һәм 0,2% CaCO3 деионизацияләнгән суда (стерилизация алдыннан рН 7,4). Орлык культуралары 27°C температурада 2 көн дәвамында әйләндергеч селкетү җайланмасында (180 әйләнү/мин) инкубацияләнде. Каты хәлдәге ферментация ярдәмендә җитештерү культурасы. Орлык культурасы (7 мл) 15 г прессланган арпадан (MUSO Co., Ltd., Япония) һәм 25 г деионизацияләнгән судан (стерилизация алдыннан рН көйләнмәгән) торган 40 г җитештерү мохите булган 500 мл К-1 колбасына күчерелде. Ферментация 30°C температурада караңгыда 14 көн дәвамында үткәрелде. Ферментация материалы 40 мл/шешә EtOH белән экстракцияләнде һәм центрифугаланды (1500 г, 4°C, 10 мин). Культура өслеге (60 мл) 10% MeOH/EtOAc катнашмасы белән экстракцияләнде. Органик катлам киметелгән басым астында парга әйләндерелеп, калдык (59,5 мг) алынды, ул кире фазалы колонкада (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 мкм, ID 10 мм × озынлыгы 250 мм) градиент элюциясе белән HPLCга дучар ителде (0–10 минут: 90%) H2O/CH3CN, 10–35 минут: 90% H2O/CH3CN - 70% H2O/CH3CN (градиент), 35–45 минут: 90% H2O/EtOH, 45–155 минут: 90% H2O/EtOH - 100% EtOH (градиент (градиент), 155–200 мин: 100% EtOH) 1,5 мл/мин агым тизлегендә, кумамонамид (1,36,0 мг) ак аморф порошок рәвешендә аерылып алынды.
Кумамотоамид(1); 1H-ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Гц, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Гц 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Гц, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-ЯМР (125 МГц, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ исәпләнгән кыйммәт: 141.0659, үлчәнгән кыйммәт: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 см–1.
Колумбия орлыклары (Col-0) тикшеренүләр өчен рөхсәт белән Arabidopsis биологик ресурслар үзәгеннән (ABRC) алынды. Col-0 орлыклары безнең лаборатория шартларында үрчетелде һәм сакланды, шулай ук кыргый типтагы Arabidopsis үсемлекләре буларак кулланылды. Arabidopsis орлыклары өслек стерилизацияләнде һәм 2% сахароза (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-морфолино)этансульфон кислотасы (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) һәм 1,5% агар (Fujifilm Wako Pure Chemical) булган ярты ныклыктагы Murashige һәм Skoog мохитендә, рН 5,7, 23 °C температурада һәм даими яктылыкта үстерелде. phs1-1 мутантының орлыклары Т. Хашимото (Нара фән һәм технология институты) тарафыннан бирелде.
SR-1 штаммы орлыклары Т. Хашимото (Нара фән һәм технология институты) тарафыннан бирелгән һәм кыргый типтагы тәмәке үсемлекләре буларак кулланылган. Тәмәке орлыклары өслектә стерильләштерелгән һәм шытуны стимуллаштыру өчен өч төн стериль суда чылатылган, аннары 2% сахароза, 0,05% (w/v) MES һәм 0,8% геллан сагызы (Fujifilm Wako Pure Chemical) Мурашиге һәм Скоог мохите) рН 5,7 булган ярты көчле эремәгә салынган һәм даими яктылык астында 23°C температурада инкубацияләнгән.
Tak-1 штаммы Т. Кохчи (Киото университеты) тарафыннан бирелгән һәм бавырны өйрәнү өчен стандарт эксперименталь берәмлек буларак кулланылган. Гемма стерильләштерелгән культуралы үсемлекләрдән алынган, аннары 1% сахароза һәм 0,3% геллан сагызы булган Gamborg B5 мохитенә (Fujifilm Wako Pure Chemical) капланган һәм 23°C температурада өзлексез яктылык астында инкубацияләнгән.
Тәмәке BY-2 күзәнәкләре (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) С. Хасезава (Токио университеты) тарафыннан тәкъдим ителде. BY-2 күзәнәкләре модификацияләнгән Линсмейер һәм Скуг мохитендә 95 тапкыр сыекландырылды һәм атна саен 2,4-дихлорфеноксиацетик кислота белән тулыландырылды 32 . Күзәнәк суспензиясе караңгыда 27°C температурада 130 әйләнү/мин тизлектә әйләндергеч селкетү җайланмасында катнаштырылды. Күзәнәкләрне яңа мохитнең 10 тапкыр зуррак күләме белән юыгыз һәм шул ук мохиттә кабат суспензияләгез. Чәчәк капустасы мозаикасы вирусы 35S промоторы астында TagRFP-TUA6 микротөтүк маркерын яки GFP-ABD2 актин җеп маркерын тотрыклы рәвештә экспрессияләүче BY-2 трансген күзәнәк линияләре тасвирланганча булдырылды 33,34,35. Бу күзәнәк линияләрен оригиналь BY-2 күзәнәк линиясе өчен кулланылган процедураларга охшаш процедуралар ярдәмендә саклап торырга һәм синхронлаштырырга мөмкин.
HeLa күзәнәкләре 37°C температурадагы инкубаторда 5% CO2 белән 10% феталь сыер сывороткасы, 1,2 U/мл пенициллин һәм 1,2 мкг/мл стрептомицин өстәлгән Дульбекко модификацияләнгән Eagle's мохитендә (DMEM) (Life Technologies) үстерелде.
Бу кулъязмада сурәтләнгән барлык экспериментлар да Япониянең биокуркынычсызлык кагыйдәләре һәм күрсәтмәләренә туры китереп башкарылды.
Кушылмалар диметилсульфоксидта (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) төп эремә буларак эретелде һәм Arabidopsis һәм тәмәке өчен MS мохитендә яки бавыр өчен Gamborg B5 мохитендә суюлтылды. Тамыр үсешен тоткарлау анализы өчен, күрсәтелгән кушылмалар яки DMSO булган агар мохитенә бер тәлинкәгә 10нан артык орлык чәчелде. Орлыклар үсеш камерасында 7 көн инкубацияләнде. Үсентеләр фотога төшерелде һәм тамырларның озынлыгы үлчәнде. Arabidopsis шыту анализы өчен, бер тәлинкәгә 48 орлык 200 мкМ кушылма яки DMSO булган агар мохитенә чәчелде. Arabidopsis орлыклары үсеш камерасында үстерелде һәм шыткан үсентеләр саны шытканнан соң 7 көн үткәч саналды (dag). Тәмәке шыту анализы өчен, бер тәлинкәгә 24 орлык 200 мкМ KAND яки DMSO булган агар мохитенә чәчелде. Тәмәке орлыклары үсеш камерасында үстерелде һәм шыткан үсентеләр саны 14 көннән соң саналды. Бавыр кортлары үсешен тоткарлау анализы өчен, һәр пластинадан 9 эмбрион күрсәтелгән концентрацияләрдә KAND яки DMSO булган агар мохитенә салынды һәм үсеш камерасында 14 көн инкубацияләнде.
Тамыр меристемасының оешканлыгын күрү өчен 5 мг/мл пропидий йодиды (PI) белән буялган үсентеләр кулланыгыз. PI сигналлары TCS SPE конфокаль лазер сканерлау микроскопы (Leica Microsystems) ярдәмендә флуоресценция микроскопиясе ярдәмендә күзәтелде.
Тамырларны β-глюкуронидаза (GUS) белән гистохимик буяу Malami һәм Benfey36 тарафыннан тасвирланган протокол буенча башкарылды. Үсентеләр төн буе 90% ацетонда фиксацияләнде, GUS буферында 0,5 мг/мл 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-d-глюкурон кислотасы белән 1 сәгатькә буялды һәм гидратланган хлоральдегид эремәсенә (8 г хлоральгидрат, 2 мл су һәм 1 мл глицерин) урнаштырылды һәм Axio Imager M1 микроскопы (Carl Zeiss) ярдәмендә дифференциаль интерференция контраст микроскопиясе ярдәмендә күзәтелде.
Вертикаль рәвештә урнаштырылган тәлинкәләрдә үстерелгән 7 көнлек үсентеләрдә тамыр почмаклары үлчәнде. 6 нчы адымда тасвирланганча, тамыр почмагын гравитация векторы юнәлешеннән үлчәгез.
Кортикаль микротүтүкчәләрнең урнашуы тасвирланганча күзәтелде, протоколга кечкенә үзгәрешләр кертелде 37. Анти-β-тубулин антитәнчеге (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) һәм Alexa Fluor 488 белән конъюгацияләнгән тычканга каршы IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) 1:1000 һәм 1:100 нисбәтендә беренчел һәм икенчел антитәнчекләр буларак кулланылды. Флуоресценция рәсемнәре TCS SPE конфокаль лазер сканерлау микроскопы (Leica Microsystems) ярдәмендә алынды. Z-стек рәсемнәрен алыгыз һәм җитештерүче күрсәтмәләренә туры китереп максималь интенсивлык проекцияләрен булдырыгыз.
HeLa күзәнәкләренең пролиферациясен тикшерү җитештерүче күрсәтмәләренә туры китереп, 8 нче күзәнәк санау комплекты (Dojindo) ярдәмендә башкарылды.
E. coli DH5α үсеше 600 нм (OD600) спектрофотометр ярдәмендә культурадагы күзәнәк тыгызлыгын үлчәү юлы белән анализланды.
Трансген BY-2 күзәнәкләрендә цитоскелет оешмасы CSU-X1 конфокаль сканерлау җайланмасы (Yokogawa) һәм sCMOS камерасы (Zyla, Andor Technology) белән җиһазландырылган флуоресцент микроскоп ярдәмендә күзәтелде. Цитоскелет тыгызлыгы сурәт анализы ярдәмендә бәяләнде, ул тасвирланганча ImageJ программасы ярдәмендә конфокаль сурәтләрдәге цитоплазматик пиксельләр арасында цитоскелет пиксельләренең процентын санлаштырды38,39.
BY-2 күзәнәкләрендә күзәнәк үлемен ачыклау өчен, күзәнәк суспензиясенең бер өлеше бүлмә температурасында 10 минут дәвамында 0,05% Эванс зәңгәре белән инкубацияләнде. Үлгән күзәнәкләрне сайлап Эванс зәңгәре белән буяу, буяуның тере күзәнәкләрдән бөтен плазма мембранасы белән чыгарылуына бәйле40. Буялган күзәнәкләр якты кырлы микроскоп (BX53, Olympus) ярдәмендә күзәтелде.
HeLa күзәнәкләре 10% FBS белән тулыландырылган DMEMда 37°C һәм 5% CO2 температурада дымландырылган инкубаторда үстерелде. Күзәнәкләр 37°C температурада 6 сәгать дәвамында 100 мкМ KAND 11, кумамонам кислотасы 6, кумамонамид 1, 100 нг/мл колцемид (Gibco) яки 100 нг/мл Nocodmaze (Sigma) белән эшкәртелде. Күзәнәкләр бүлмә температурасында 10 минут MetOH белән, аннары 5 минут ацетат белән фиксацияләнде. Фиксацияләнгән күзәнәкләр 0,5% BSA/PBS белән сыекландырылган β-тубулин беренчел антитәнчеге (1D4A4, Proteintech: 66240-1) белән 2 сәгать инкубацияләнде, 3 тапкыр TBST белән юылды, аннары Alexa Fluor кәҗә антитәнчеге белән инкубацияләнде. 488 1 сәгать. – Тычкан IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) һәм 0,5% BSA/PBS эремәсендә 15 нг/мл 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI). TBST белән өч тапкыр юганнан соң, буялган күзәнәкләр Nikon Eclipse Ti-E инверсияләнгән микроскопында күзәтелде. Рәсемнәр MetaMorph программасы (Molecular Devices) ярдәмендә суытылган Hamamatsu ORCA-R2 CCD камерасы белән төшерелде.
Бастырылган вакыты: 2024 елның 17 июне