Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт.Сез кулланган браузерның версиясе чикләнгән CSS ярдәме.Иң яхшы нәтиҗәләр өчен без сезнең браузерның яңа версиясен кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'та туры килү режимын сүндерегез).Шул ук вакытта, дәвамлы ярдәмне тәэмин итү өчен, без сайтны стилизациясез яки JavaScript күрсәтмибез.
Табигый продуктларны табу һәм файдалы куллану кеше тормышын яхшыртырга ярдәм итә ала.Чүп үләннәрен контрольдә тоту өчен үсемлек үсешен тыя торган химикатлар гербицидлар буларак киң кулланыла.Төрле гербицидлар куллану ихтыяҗы аркасында, яңа эш механизмнары булган кушылмаларны ачыкларга кирәк.Бу тикшеренүдә без Streptomyces werraensis MK493-CF1 N -alkoxypyrrole кушылмасы, кумамонамид романын таптык һәм тулы синтез процессын булдырдык.Биологик эшчәнлек анализлары аша без урс-моноам кислотасының урс-моноамидның синтетик арадашы һәм потенциал булуын ачыкладык.үсемлек үсеше ингибиторы.Моннан тыш, без төрле урбенон кислотасы тудыруларын эшләдек, шул исәптән урбенилокси туемы (UDA), ул гербицид активлыгы HeLa күзәнәкләренең үсешенә тискәре йогынты ясамыйча.Без шулай ук урмотон кислотасы туемнары үсемлек микротубулаларын боза икәнен таптык;өстәвенә, KAND актин филаментларына тәэсир итә һәм күзәнәк үлеменә китерә;Бу күпкырлы эффектлар билгеле микротубул ингибиторларыннан аерылып торалар һәм яңа гербицидлар үсешендә мөһим өстенлекне күрсәтүче урсон кислотасы өчен яңа эш механизмын тәкъдим итәләр.
Файдалы табигый продуктларны һәм алардан ясалган әйберләрне табу һәм куллану - кеше тормышының сыйфатын яхшырту чарасы.Микроорганизмнар, үсемлекләр һәм бөҗәкләр җитештергән икенчел метаболитлар медицинада һәм авыл хуҗалыгында зур уңышларга ирештеләр.Күпчелек антибиотиклар һәм лейкозга каршы препаратлар табигый продуктлардан эшләнде.Моннан тыш, төрле төрләрпестицидлар, фунгицидлар һәм гербицидлар бу табигый продуктлардан авыл хуҗалыгында куллану өчен алынган.Аерым алганда, чүп үләннәрен контрольдә тотучы гербицидлар хәзерге авыл хуҗалыгында уңышны арттыру өчен мөһим корал, һәм төрле кушылмалар коммерциядә кулланыла.Фотосинтез, аминокислота метаболизмы, күзәнәк стенасы синтезы, митозны көйләү, фитохормон сигнализациясе яки протеин синтезы кебек үсемлекләрдә берничә күзәнәк процессы гербицидларның типик максаты булып санала.Микротубул функциясен тыя торган кушылмалар - гербицидларның гомуми сыйныфы, митотик көйләүгә тәэсир итеп үсемлек үсешенә тәэсир итә2.
Микротубуллар цитоскелетонның компонентлары һәм эукариотик күзәнәкләрдә киң сакланган.Тубулин гетеродимеры α-тубулиннан һәм β-тубулиннан тора, сызыклы микротубул протофиламентларын формалаштыра, 13 протофиламент цилиндрик структураны тәшкил итә.Микротубуллар үсемлек күзәнәкләрендә берничә роль уйныйлар, шул исәптән күзәнәк формасын, күзәнәк бүленешен һәм күзәнәкләр эчендә транспортны билгеләү3,4.Antсемлек күзәнәкләрендә интерфаз плазма мембранасы астындагы микротубуллар бар, һәм бу корталь микротубуллар целлюлоза микрофибрилларын целлюлоза синтаз комплексларын көйләү аша контрольдә тоталар дип уйланыла4,5.Тамыр очының тиз озынлыгы зонасында булган тамыр эпидермаль күзәнәкләренең корталь микротубуллары соңрак урнашкан, һәм целлюлоза микрофиберлары бу микротубулаларга иярәләр һәм күзәнәк киңәю юнәлешен чиклиләр, шуның белән анисотроп күзәнәкләр озынлыгын арттыралар.Шуңа күрә микротубул функциясе үсемлек морфологиясе белән тыгыз бәйләнгән.Тубулинны кодлаучы геннардагы аминокислоталарны алыштыру корталь микротубул массивларының шомлануына һәм Арабидопс 6,7 сул яисә уң як үсешенә китерә.Шулай ук, микротубул динамикасын көйләүче микротубул белән бәйле протеиннардагы мутацияләр тамырның бозылуына китерергә мөмкин8,9,10,11,12,13.Моннан тыш, микротубулны бозучы гербицидлар белән дәвалау, дисопирамид кебек, шулай ук претилахлор дип тә атала, шулай ук сул яклы облик тамырының үсүенә китерә14.Бу мәгълүматлар шуны күрсәтә: үсемлек үсеш юнәлешен билгеләү өчен микротубул функциясен төгәл көйләү бик мөһим.
Төрле микротубул ингибиторлары табылды, һәм бу препаратлар циткелет тикшеренүләренә, шулай ук авыл хуҗалыгына һәм медицинага зур өлеш керттеләр2.Аерым алганда, оризалин, динитроанилин кушылмалары, дисопирамид, бензамид белән бәйле кушылмалар, һәм аларның аналоглары микротубул функциясен тоткарлый һәм шуның белән үсемлек үсешен тоткарлый ала.Шуңа күрә алар гербицидлар буларак киң кулланыла.Ләкин, микротубуллар үсемлек һәм хайван күзәнәкләренең мөһим компоненты булганлыктан, күпчелек микротубул ингибиторлары ике күзәнәк тибына да цитотоксик.Шуңа күрә, гербицидлар буларак танылган булуларына карамастан, практик максатларда чикләнгән санлы антимикротубул агентлары кулланыла.
Стрептомизлар - аэроб, грамм-позитив, филаментлы бактерияләрне үз эченә алган һәм киң икенчел метаболитлар җитештерү сәләте белән киң танылган Стрептомизлар гаиләсе.Шуңа күрә ул яңа биологик актив табигый продуктларның иң мөһим чыганакларының берсе санала.Хәзерге тикшеренүдә без coumamonamide дип аталган яңа кушылма таптык, ул Streptomyces werraensis MK493-CF1 һәм S. werraensis ISP 5486. изоляцияләнгән. билгеләнде.синтез.Урсмон кислотасы, урсмоноамидның синтетик арадашы һәм аннан ясалган әйберләр, популяр модель үсемлеге Arabidopsis taliana үсүен һәм үсүен тоткарлый.Структур-эшчәнлек бәйләнешен өйрәнгәндә, без C9 белән урсон кислотасына үзгәртелгән кушылманың, урсон кислотасының нонилокси туемы (KAND) дип аталган кушылуның үсүгә һәм үсүгә ингибитор эффектын сизелерлек көчәйтүен ачыкладык.Шунысы игътибарга лаек, яңа ачылган үсемлек үсеш ингибиторы тәмәке һәм бавыр кортының үсешенә тәэсир итте һәм бактерияләр яки HeLa күзәнәкләренә цитотоксик түгел иде.Моннан тыш, кайбер урмотон кислотасы туемнары бозылган тамыр фенотибын тудыралар, бу туемнар микротубулаларга турыдан-туры яки турыдан-туры йогынты ясыйлар.Бу идеяга туры китереп, безнең иммунохистохимик яки флуоресцент белоклар белән язылган микротубулларны күзәтүләребез KAND белән эшкәртү микротубулларны деполимеризацияләвен күрсәтә.Моннан тыш, кумамотон кислотасы туемнары белән дәвалау актин микрофиламентларын бозды.Шулай итеп, без үсемлекнең яңа ингибиторын таптык, аның уникаль эш механизмы цитоскелетонны юк итү белән бәйле.
MK493-CF1 штаммы Токиодагы Шинагава-ку туфрагыннан аерылды.MK493-CF1 штаммы яхшы таралган стромаль мицелий формалаштырды.16S рибосомаль РНК генының өлешчә эзлеклелеге билгеләнде (1422 б.т.).Бу штамм С. werraensis белән бик охшаган (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: типик штамм, 99,93%).Бу нәтиҗәгә нигезләнеп, бу штаммның S. werraensis төре белән тыгыз бәйләнештә булуы ачыкланды.Шуңа күрә без вакытлыча бу штаммны S. werraensis MK493-CF1 дип атадык.S. werraensis ISP 5486T шулай ук шул ук биоактив кушылмалар җитештерә.Бу микроорганизмнан табигый продуктлар алу турында аз тикшерүләр булганлыктан, алга таба химик тикшеренүләр үткәрелде.С. werraensis MK493-CF1 эшкәртелгәннән соң, 14 көн дәвамында 30 ° C температурада каты дәүләт ферментациясе белән, 50% EtOH белән чыгарылды.59,5 мг чиста экстракт алу өчен 60 мл үрнәк киптерелгән.Чиста экстракт N-метокси-1Х-пиррол-2-карбоксамид бирү өчен HPLC кире этапка дучар ителде (1, кумамонамид дип аталган, 36,0 мг).Гомуми күләме чиста экстрактның якынча 60% тәшкил итә.Шуңа күрә без кумамотоамид 1 үзлекләрен җентекләп өйрәнергә булдык.
Coumamonamide 1 - ак аморф порошогы һәм югары резолюцияле масса спектрометриясе (HRESIMS) C6H8N2O2 раслый (1 нче рәсем).Бу кушылманың C2 белән алмаштырылган пиррол фрагменты δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4,8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2,5, δH 1H NMR спектрында: 4,5 Гц) белән аерылып тора. , H-5) һәм δH 6.78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), һәм 13C NMR спектрында дүрт sp2 углерод атомы барлыгын күрсәтәләр.C2 позициясендә амид төркеменең булуы HMBC корреляциясе белән C-3 протоныннан амид карбонил углеродына δC 161.1 дәрәҗәсендә бәяләнде.Моннан тыш, 1 H һәм 13 C NMR иң югары δH 4.10 (3H, S) һәм δC 68.3 молекулада N-метокси төркемнәренең булуын күрсәтәләр.Метокси төркеменең дөрес позициясе спектроскопик анализ ярдәмендә билгеләнмәгән булса да, көчәйтелгән аерма спектроскопиясе һәм атом ремонтлау кыскартуы (NOEDF), N-метокси-1Х-пиррол-2-карбоксамид беренче кандидат кушылмасы булды.
1нең дөрес структурасын ачыклау өчен, гомуми синтез ясалды (2а рәсем).Коммерцияле 2-аминопиридин 2-ны m-CPBA белән дәвалау нәтиҗәсендә тиешле N-оксид 3 санлы уңыш китерде.2-аминоазидациядән соң, Абрамович сурәтләгән циклоконденсация реакциясе бензолда 90 ° C температурада үткәрелде, кирәкле 1-гидрокси-1Х-пиррол-2-карбонитрил 5 граммда.Тизлек 60% (ике этап).15,16.Метиляция һәм 4 гидролизы аннары 1-метокси-1Х-пиррол-2-карбоксил кислотасы ("кумотон кислотасы" дип атала, 6) яхшы уңышта (70%, ике адым) бирде.Ниһаять, су аммиак кулланып, кислота хлорид арада 6 аша амидация Кумамото амидны 98% уңышта бирде.Синтезланган 1нең барлык спектраль мәгълүматлары изоляцияләнгән 1гә охшаган, шуңа күрә 1 структурасы билгеләнде;
Урбенамид һәм урбен кислотасының биологик активлыгын гомуми синтезлау һәм анализлау.а) Кумамото амидның гомуми синтезы.б) Sevenиде көнлек кыргый типтагы Арабидопс Колумбия (Кол) үсентеләре Мурашиге һәм Ског (МС) тәлинкәләрендә кумамонамид 6 яки кумамонамид 1 булган концентрацияләрдә үстерелгән.Масштаб сызыгы = 1 см.
Беренчедән, без урбенамидның һәм аның арадашчыларының биологик эшчәнлеген бәяләдек, аларның үсемлек үсешен модульләштерү сәләте өчен.Без урсмонамид 1 яки урсмон кислотасы 6 концентрациясен MS агар урта һәм культуралы Arabidopsis taliana үсентеләренә өстәдек.Бу анализлар күрсәткәнчә, югары концентрацияләр (500 μM) 6 тамыр үсүен тоткарлый (2б рәсем).Алга таба, без N1 позициясен 6 алыштырып, төрле туемнар тудырдык һәм аларда структура - эшчәнлек мөнәсәбәтләрен өйрәндек (аналог синтез процессы Ярдәмче Мәгълүматта (SI) тасвирланган).Арабидопс үсентеләре 50 μМ урсон кислотасы туемнары булган, тамыр озынлыгы үлчәнгән.рәсемдә күрсәтелгәнчә.3а, б, һәм С1 рәсемнәрендә күрсәтелгәнчә, кумамо кислоталары төрле озынлыктагы сызыклы алкокси чылбырларга ия (9, 10, 11, 12, 13) яки N1 позициясендә зур алкокси чылбырлар (15, 16, 17).Туганнар тамыр үсүенең зур тыюлыгын күрсәттеләр.Моннан тыш, без 200 μM 10, 11, яки 17 куллануны ачыкладык (3c һәм S2 рәсемнәр).
Кумамото амид һәм аның белән бәйле кушылмаларның структур-эшчәнлек бәйләнешен өйрәнү.а) Аналогларның структурасы һәм синтез схемасы.б) 50 көнлек кумамонамид туемнары белән яки MSсыз үскән 7 көнлек үсентеләрнең тамыр озынлыгы күләме.Йолдызлыклар оятсыз дәвалау белән зур аермаларны күрсәтәләр (t тест, б<0.05).n>18. Мәгълүматлар уртача ± SD рәвешендә күрсәтелә.nt "сыналмаган" дигәнне аңлата, чөнки орлыкларның 50% тан артыгы үсмәгән.в) 200 μM кумамонамид һәм аңа бәйле кушылмалар белән 7 көн эчендә MS уртача инкубацияләнгән эшкәртелгән орлыкларның үсү дәрәҗәсен санлау.Йолдызлыклар шам белән эшкәртү белән аерылып торалар (хи-квадрат тест).n = 96.
Кызык, алкил ян чылбырларын C9-тан озынрак өстәү ингибиторлык активлыгын киметте, кумамотой кислотасы белән бәйле кушылмалар биологик активлыгын күрсәтү өчен билгеле зурлыктагы чылбыр таләп итә.
Структура-эшчәнлек бәйләнеше анализы күрсәткәнчә, C9 урсон кислотасына үзгәртелгән һәм урсон кислотасының нонилокси туемы (алга таба KAND 11 дип атала) үсемлек үсешенең иң эффектив ингибиторы булганлыктан, без KAND 11. җентеклерәк характеристика үткәрдек. Арабидопсны дәвалау. 50 μM KAND 11 белән үсүне тулысынча диярлек кисәттеләр, ә түбән концентрацияләр (40, 30, 20, яки 10 μM) KAND 11 дозага бәйле рәвештә тамыр үсүен тоткарладылар (4а рәсем, б).KAND 11 тамыр меристемының яшәешенә йогынты ясыймы, юкмы икәнлеген тикшерү өчен, без пропидий йоды (PI) белән буялган тамыр меристемаларын тикшердек һәм меристем өлкәсенең зурлыгын үлчәдек.25 μM KAND-11 булган уртада үскән үсентеләрнең меристемы 151,1 ± 32,5 мм, ә DMSO булган контроль шартларда үскән үсентеләрнең меристемы 264,7 ± 30,8 μm (4c рәсем, д) , бу KAND-11 кәрәзле активлыкны торгызганын күрсәтә.таралу.Тамыр меристемы.Моның белән эзлекле, KAND 11 дәвалау күзәнәк бүленеше маркеры CDKB2 күләмен киметте; 1p :: CDKB2; тамыр меристемасында 1-GUS сигналы (4e рәсем) 17.Бу нәтиҗәләр шуны күрсәтә: KAND 11 күзәнәк таралу активлыгын киметеп тамыр үсүен тоткарлый.
Урбенон кислотасы туемнарының (урбенилокси туемнары) үсешенә ингибитор эффектын анализлау.а) 7 көнлек кыргый типтагы Кол үсентеләре MS тәлинкәләрендә үскән KAND 11 концентрацияләре белән үскәннәр. Масштаб бар = 1 см.б) тамыр озынлыгының күләме.Хатлар зур аермаларны күрсәтәләр (Тукай HSD тесты, б<0.05).n>16. Мәгълүматлар уртача ± SD рәвешендә күрсәтелә.в) пропидий йодлы буялган кыргый типтагы Кол тамырларының конфокаль микроскопиясе.Масштаб сызыгы = 100 мм.г) тамыр меристемының күләме (n = 10 - 11).Статистик аермалар т-тест ярдәмендә билгеләнде (б<0.05).Барлар уртача меристем күләмен күрсәтәләр.д) дифференциаль интерфейс контрасты (DIC) CDKB2 конструкциясе булган тамыр меристемының микроскопиясе;1про: CDKB2;1-GUS 5 көнлек үсентеләргә буялган һәм буялган, MS тәлинкәләрендә 25 µM KAND анализы белән яки булмаса.
КАНД 11 фитотоксиклыгы тагын бер дикотиледонлы үсемлек, тәмәке (Nicotiana tabacum), һәм җир үсемлекләренең төп модель организмы, бавыр кортлары (Маршантия полиморфасы) ярдәмендә сынады.Арабидопис очрагында булган кебек, 25 μM KAND 11 булган уртада үскән SR-1 тәмәке кыска тамырлар китерде (5а рәсем).Өстәвенә, 48 орлыкның 40ы 200 μM KAND 11 булган тәлинкәләрдә чәчелде, ә барлык 48 орлык мыскыллау чараларында үсеп чыкты, бу KAND концентрацияләренең зур булуын күрсәтә (p<0.05;chi test -square) тәмәке үсүен тоткарлады.(5б рәсем).Моннан тыш, бавыр кортында бактерия үсешен тоткарлаган KAND 11 концентрациясе Арабидопсдагы эффектив концентрациягә охшаган (5с рәсем).Бу нәтиҗәләр шуны күрсәтә: KAND 11 төрле үсемлекләрнең үсешен тоткарлый ала.Аннары без башка организмнарда аю моноамид белән бәйле кушылмаларның цитотоксиклыгын тикшердек, кеше HeLa күзәнәкләре һәм Escherichia coli DH5α штаммы, югары хайваннар һәм бактерия күзәнәкләре вәкилләре буларак.Күзәнәкләр таралу тикшеренүләре сериясендә без кумамонамид 1, кумамонамид кислотасы 6, һәм KAND 11 100 μM концентрациясендә HeLa яки E. coli күзәнәкләренең үсешенә тәэсир итмәвен күрдек (5d, e).
Арабидопс булмаган организмнарда KAND 11 үсешен тыю.а) Ике атналык кыргый SR-1 тәмәке үсентеләре вертикаль урнашкан MS тәлинкәләрдә 25 μM KAND 11 булган. (b) Ике атналык кыргый типтагы SR-1 тәмәке үсентеләре горизонталь рәвештә үстерелгән. 200 μM KAND 11 булган MS тәлинкәләр. период.г) HeLa күзәнәкләренең күзәнәк таралуы.Күзәнәкләрне санау комплекты 8 (Дожиндо) ярдәмендә яшерен күзәнәкләр саны билгеле вакыт аралыгында үлчәнде.Контроль буларак, HeLa күзәнәкләре 5 μг / мл актиномицин D (Акт D) белән эшкәртелде, бу РНК полимераз транскрипциясен тыя һәм күзәнәк үлеменә китерә.Анализлар өчпочмакта башкарылды.д) Э.Коли күзәнәкләренең таралу проблемасы.E. coli үсеше OD600 үлчәү белән анализланды.Контроль буларак, күзәнәкләр 50 μг / мл ампициллин (Amp) белән эшкәртелде, бу бактерия күзәнәк стенасы синтезын тоткарлый.Анализлар өчпочмакта башкарылды.
Урамид белән бәйле кушылмалар китереп чыгарган цитотоксиклылык механизмын шифрлау өчен, без урбен кислотасы туемнарын уртача ингибитор эффектлары белән реализацияләдек.рәсемдә күрсәтелгәнчә.2б, 6а рәсемнәрендә күрсәтелгәнчә, югары концентрацияле (200 μМ) урмотон кислотасы булган агар тәлинкәләрдә үскән үсентеләр кыска һәм сул кәкре тамырлар (θ = - 23,7 ± 6.1) җитештерәләр, ә контроль уртада үскән үсентеләр, үсентеләр туры тамырлар җитештерделәр (θ = - 3,8 ± 7.1).Бу характеристик облик үсеше корталь микротубулларның эшләмәве аркасында билгеле, 14,18.Бу табышмакка туры китереп, микротубулны тотрыксызландыручы препаратлар дисопирамид һәм оризалин безнең үсеш шартларында охшаш тамыр эретүгә китерделәр (2б, 6а рәсемнәр).Шул ук вакытта, без урмотон кислотасы туемнарын сынадык һәм аларның кайберләрен сайладык, билгеле концентрацияләрдә, обли тамыр тамырының үсүенә китергән.8, 9, һәм 15 кушылмалар тамыр үсү юнәлешен 75 μM, 50 μM, һәм 40 μM үзгәрттеләр, бу кушылмалар микротубулларны эффектив тотрыксызлый ала (2б, 6а рәсем).Без шулай ук иң көчле урсолик кислотасы туемы, KAND 11, түбән концентрациядә (15 µM) сынап карадык һәм KAND 11 куллану тамыр үсүен тоткарлый һәм тамыр үсү юнәлеше тигез булмаган, алар сул якка тайпылсалар да ( Рәсем C3)..Микротубул-тотрыксызландыручы препаратларның югары концентрацияләре кайвакыт тамыр үсүенә түгел, ә үсемлек үсешенә комачаулый, шуңа күрә без KAND 11 тамыр эпидермаль күзәнәкләрендәге корталь микротубулларны күзәтеп микротубулларга йогынты ясау мөмкинлеген бәяләдек.25 μM KAND 11 белән эшкәртелгән үсенте тамырларының эпидермаль күзәнәкләрендә анти-тубулинга каршы антителалар кулланып, иммунохистохимия озынлык зонасында эпидермаль күзәнәкләрдә барлык корталь микротубулларның юкка чыгуын күрсәтте (6б рәсем).Бу нәтиҗәләр шуны күрсәтә: кумамотон кислотасы һәм аннан ясалганнар микротубулаларда турыдан-туры яки турыдан-туры эш итәләр, һәм бу кушылмалар яңа микротубул ингибиторлары.
Урсон кислотасы һәм аннан ясалганнар Арабидопс талианасында корталь микротубулларны үзгәртә.а) Күрсәтелгән концентрацияләрдә төрле урмотон кислотасы туемнары булганда үлчәнгән тамыр омтылышы почмагы.Микротубулларны тыю өчен билгеле булган ике кушылманың тәэсире: дисопирамид һәм оризалин шулай ук анализланды.Инсетта тамыр үсү почмагын үлчәү өчен кулланылган стандарт күрсәтелә.Йолдызлыклар оятсыз дәвалау белән зур аермаларны күрсәтәләр (t тест, б<0.05).n>19. Масштаб сызыгы = 1 см.б) озынлык зонасында эпидермаль күзәнәкләрдәге корталь микротубуллар.Кыргый типтагы Арабидопсдагы микротубуллар MS тәлинкәләрендә 25 μM KAND 11 яки аннан башка үскән Кол тамырлары иммунохистохимик буяу белән β-тубулин беренчел антителалар һәм Alexa Fluor-conjugated икенчел антителалар ярдәмендә визуальләштерелгән.Масштаб сызыгы = 10 мм.в) тамыр меристемындагы микротубулларның митотик төзелеше.Микротубуллар иммунохистохимик буяу ярдәмендә визуальләштерелгән.Митотик структуралар, шул исәптән пропаз зоналары, шакмаклар, фрагмопластлар, конфокаль рәсемнәрдән саналды.Уклар митотик микротубул структураларын күрсәтәләр.Йолдызлыклар оятсыз дәвалау белән зур аермаларны күрсәтәләр (t тест, б<0.05).n>9. Масштаб сызыгы = 50 мм.
Урса микротубул функциясен боза алса да, аның эш механизмы типик микротубул деполимеризацияләү агентларыннан аерылып торыр дип көтелә.Мәсәлән, дисопирамид һәм оризалин кебек микротубул деполимерлаштыручы агентларның югары концентрацияләре эпидермаль күзәнәкләрнең анисотроп киңәюенә китерә, ә KAND 11 юк.Моннан тыш, KAND 11 һәм дисопирамидның бергә кулланылуы нәтиҗәсендә берләштерелгән дисопирамидлы тамыр үсү реакциясе һәм KAND 11-индуктив үсеш ингибиясе күзәтелде (S4 рәсем).Без шулай ук гиперсенсив дисопирамид 1-1 (phs1-1) мутантның КАНД 11гә җавапын анализладык. Phs1-1 канон булмаган тубулин киназ ноктасы мутациясенә ия һәм дисопирамид белән эшкәртелгәндә кыска тамырлар чыгара9,20.phs1-1 KAND 11 булган агар уртада үскән мутант үсентеләрнең дисопирамидада үскән тамырларына охшаган кыска тамырлары булган (S5 рәсем).
Моннан тыш, без KAND 11 белән эшкәртелгән үсентеләрнең тамыр меристемасында пропаз зоналары, шакмаклар һәм фрагмопластлар кебек митотик микротубул структураларын күзәттек, CDKB2 күзәтүләренә туры килә; 1p :: CDKB2; 1-GUS, сизелерлек кимү; митотик микротубуллар саны күзәтелде (6-нчы рәсем).
Канд 11 цитотоксиклыгын субсекуляр резолюциядә характерлау өчен, без BY-2 асылмалы күзәнәкләрне KAND 11 белән эшкәрттек һәм аларның җавапларын күзәттек.Без KAND 11нең корталь микротубулларга тәэсирен бәяләү өчен, TagRFP-TUA6ны белдерүче BY-2 күзәнәкләренә KAND 11 куштык.Корталь микротубул тыгызлыгы цитоплазмик пиксель арасында цитоскелет пиксель процентын бәяләгән рәсем анализы ярдәмендә бәяләнде.Тикшеренү нәтиҗәләре күрсәткәнчә, 50 μM яки 100 μM KAND 11 белән 1 сәгать эшкәртелгәннән соң, тыгызлык 0,94 ± 0.74% яки 0,23 ± 0,28% ка кадәр кимегән, DMSO белән эшкәртелгән күзәнәкләр тыгызлыгы 1,61 ± 0.34 тәшкил иткән. % (7а рәсем).Бу нәтиҗәләр Арабидопсдагы күзәтү белән туры килә, KAND 11 дәвалау корталь микротубулларның деполимеризациясенә китерә (6б рәсем).Без шулай ук BY-2 сызыгын GFP-ABD маркалы актин филаментлары белән тикшердек, шул ук концентрацияле KAND 11 белән эшкәртелгәннән соң һәм KAND 11 дәвалау актин филаментларын бозганын күрдек.50 μM яки 100 μM KAND 11 белән 1 сәг. Актин филамент тыгызлыгын 1,20 ± 0,62% яки 0,61 ± 0,26% ка киметте, ә DMSO белән эшкәртелгән күзәнәкләрнең тыгызлыгы 1,69 ± 0,51% иде (2 нче рәсем).7б).Бу нәтиҗәләр актин филаментларына тәэсир итмәгән пропизамид һәм В латрункулины, микротубулаларга тәэсир итмәгән актин деполимеризаторы (SI рәсем S6) белән капма-каршы.Моннан тыш, кумамонамид 1, кумамонамид кислотасы 6, яки KAND 11 белән дәвалау HeLa күзәнәкләрендәге микротубулларга тәэсир итмәде (SI Рәсем S7).Шулай итеп, KAND 11 эш механизмы билгеле цитоскелетон өзгечләреннән аерылып тора дип санала.Моннан тыш, безнең KAND 11 белән эшкәртелгән BY-2 күзәнәкләрен микроскопик күзәтү KAND 11 дәвалау вакытында күзәнәк үлеме башлануын күрсәтте һәм KAND 11 дәвалауның 30 минутыннан соң Эвансның зәңгәр төсле үле күзәнәкләр өлеше сизелерлек артмаганын күрсәтте. 50 μM яки 100 μM KAND белән 90 минут дәваланганнан соң, үле күзәнәкләр саны тиешенчә 43,7% яки 80,1% ка артты (7с рәсем).Бергә тупланган бу мәгълүматлар шуны күрсәтә: роман урсолик кислотасы туемы KAND 11 - элек билгеле булмаган эш механизмы булган үсемлеккә хас циткелет ингибиторы.
KAND корталь микротубулларга, актин филаментларына, тәмәке BY-2 күзәнәкләренең яшәешенә тәэсир итә.а) TagRFP-TUA6 булганда BY-2 күзәнәкләрендәге корталь микротубулларны визуальләштерү.KAND 11 (50 μM яки 100 μM) яки DMSO белән эшкәртелгән BY-2 күзәнәкләре конокаль микроскопия белән тикшерелде.Кортик микротубул тыгызлыгы 25 бәйсез күзәнәкнең микрографларыннан исәпләнде.Хатлар зур аермаларны күрсәтәләр (Тукай HSD тесты, б<0.05).Масштаб сызыгы = 10 мм.б) BY-2 күзәнәкләрендәге корталь актин филаментлары GFP-ABD2 булганда визуальләштерелгән.KAND 11 (50 μM яки 100 μM) яки DMSO белән эшкәртелгән BY-2 күзәнәкләре конокаль микроскопия белән тикшерелде.Корталь актин филаментларының тыгызлыгы 25 бәйсез күзәнәкнең микрографларыннан исәпләнде.Хатлар зур аермаларны күрсәтәләр (Тукай HSD тесты, б<0.05).Масштаб сызыгы = 10 мм.в) Эванс зәңгәр буяу белән үлгән BY-2 күзәнәкләрен күзәтү.KAND 11 (50 μM яки 100 μM) яки DMSO белән эшкәртелгән BY-2 күзәнәкләре якты кыр микроскопиясе белән тикшерелде.n = 3.Масштаб сызыгы = 100 мм.
Яңа табигый продуктларны табу һәм куллану кеше тормышының төрле өлкәләрендә, шул исәптән медицина һәм авыл хуҗалыгында, зур уңышларга китерде.Табигый ресурслардан файдалы кушылмалар алу өчен тарихи тикшеренүләр үткәрелде.Аерым алганда, актиномицетлар нематодлар өчен антипаразитик антибиотиклар буларак файдалы, билгеле, авермектин, ивермектин һәм бломицинның кургаш кушылмасы һәм андагы туемнар кебек төрле икенчел метаболитлар җитештерә алулары аркасында, антиканцер агенты буларак кулланыла21,22.Нәкъ шулай ук, актиномицетлардан төрле гербицид кушылмалары табылды, аларның кайберләре коммерциядә кулланыла1,23.Шуңа күрә, табигый продуктларны биологик эшчәнлек белән изоляцияләү өчен актиномицет метаболитларын анализлау эффектив стратегия булып санала.Бу тикшеренүдә без С.Верраенсисдан яңа кушылма, кумамонамид таптык һәм аны уңышлы синтезладык.Урсон кислотасы - урбенамид һәм аннан ясалган синтетик арадаш.Ул характерлы тамыр бөдрәсенә китерергә, уртача һәм көчле гербицид активлыгын күрсәтергә, һәм үсемлек микротубулларына турыдан-туры яки турыдан-туры зыян китерергә мөмкин.Ләкин, урмотон кислотасының эш механизмы булган микротубул ингибиторларыннан аерылып торырга мөмкин, чөнки KAND 11 шулай ук актин филаментларын боза һәм күзәнәк үлеменә китерә, бу урмотон кислотасы һәм аның туемнары цитоскелет структураларына тәэсир итә торган көйләү механизмын тәкъдим итә..
Урбенон кислотасының тагын да җентекле характеристикасы урбенон кислотасының эш механизмын яхшырак аңларга ярдәм итәчәк.Аерым алганда, чираттагы максат - урсон кислотасының кыскартылган микротубулларга бәйләү сәләтен бәяләү, урсон кислотасы һәм аның туемнары турыдан-туры микротубулаларда эшлиләрме, аларны деполимерлаштыралармы, яисә аларның эшләре микротубулларның дестабилизациясенә китерәме-юкмы икәнен ачыклау.Моннан тыш, микротубуллар туры максат булмаган очракта, үсемлек күзәнәкләрендә урсон кислотасының эш урынын һәм молекуляр максатларын ачыклау бәйләнешле кушылмаларның үзлекләрен һәм гербицид активлыгын яхшырту ысулларын тагын да яхшырак аңларга ярдәм итәчәк.Безнең биоактивлык анализы урон кислотасының уникаль цитотоксик сәләтен ачты, Arabidopsis taliana, тәмәке һәм бавыр кортлары кебек үсемлекләр, ләкин Э.Коли да, HeLa күзәнәкләре дә тәэсир итмәде.Хайван күзәнәкләренә аз токсиклылык урсон кислотасы туемнарының өстенлеге, әгәр алар ачык авыл хуҗалыгы кырларында гербицидлар булып эшләнсәләр.Чыннан да, микротубуллар эукариотларда киң таралган структуралар булганлыктан, үсемлекләрдә аларны сайлап алу гербицидлар өчен төп таләп булып тора.Мәсәлән, тубулинга турыдан-туры бәйләнгән һәм полимеризацияне тыя торган микротубул деполимеризацияләүче пропизамид, хайван күзәнәкләренә аз токсиклылыгы аркасында гербицид буларак кулланыла24.Дисопирамидтан аермалы буларак, бензамидларның максатчан үзенчәлекләре бар.Plantсемлек микротубулларына өстәп, RH-4032 яки бензоксамид шулай ук хайван күзәнәкләренең яки оомицетларның микротубулаларын тоткарлый, һәм залиламид аз фитотоксиклыгы аркасында фунгицид буларак кулланыла25,26,27.Яңа ачылган аю һәм аннан ясалган әйберләр үсемлекләргә каршы сайлап алынган цитотоксиклылык күрсәтәләр, ләкин әйтергә кирәк, алга таба модификацияләр аларның максатчанлыгын үзгәртә ала, патогеник гөмбәләр яки оомицеталар белән идарә итү өчен өстәмә туемнар бирә ала.
Урбенон кислотасының уникаль үзлекләре һәм аннан ясалганнар гербицидлар булып үсү һәм тикшеренү кораллары буларак куллану өчен файдалы.Cитоскелетонның үсемлек күзәнәк формасын контрольдә тоту мөһимлеге киң таныла.Элегерәк үткәрелгән тикшеренүләр күрсәткәнчә, үсемлекләр морфогенезны дөрес контрольдә тоту өчен микротубул динамикасын контрольдә тотып, корталь микротубул оешмасының катлаулы механизмнарын үстергәннәр.Микротубул эшчәнлеген көйләү өчен җаваплы күп санлы молекулалар ачыкланды, һәм алар белән бәйле тикшеренүләр әле дә дәвам итә3,4,28.Хәзерге вакытта үсемлек күзәнәкләрендәге микротубул динамикасын аңлау корталь микротубул оешмасы механизмнарын тулысынча аңлатмый.Мәсәлән, дисопирамид та, оризалин да микротубулларны деполимерлаштыра алсалар да, дисопирамид тамырның бозылуына китерә, ә оризалин чагыштырмача йомшак эффектка ия.Моннан тыш, микротубулларны тотрыклыландыручы тубулиндагы мутацияләр тамырларда декстроротациягә китерәләр, ә микротубул динамикасын тотрыклыландыручы паклитаксель юк.Шуңа күрә урсолик кислотасының молекуляр максатларын өйрәнү һәм ачыклау үсемлек кортик микротубулаларын көйләү турында яңа мәгълүмат бирергә тиеш.Нәкъ шулай ук, дисопирамид кебек бозылган үсешне пропагандалаучы химик матдәләр, оризалин яки кумамотор кислотасы кебек аз эффектив химик матдәләр белән чагыштыру, үсешнең ничек бозылганын күрсәтәчәк.
Икенче яктан, оборона белән бәйле циткелетны үзгәртеп кору - урсон кислотасының цитотоксиклыгын аңлату өчен тагын бер мөмкинлек.Патогенны инфекцияләү яки эликиторны үсемлек күзәнәкләренә кертү кайвакыт цитоскелетонның җимерелүенә һәм соңыннан күзәнәк үлеменә китерә29.Мәсәлән, оомицеттан алынган криптоксантин тәмәке күзәнәкләре үлеме алдыннан микротубулларны һәм актин филаментларын боза, KAND дәвалау 30,31 белән охшаган.Урсон кислотасы китергән оборона реакцияләре һәм кәрәзле реакцияләр арасында охшашлыклар безне гомуми кәрәзле процесслар тудыра дип фаразларга этәрде, гәрчә урсон кислотасының криптоксантинга караганда тизрәк һәм көчлерәк эффекты күренеп тора.Ләкин, тикшеренүләр күрсәткәнчә, актин филаментларының өзелүе үз-үзеннән күзәнәк үлеменә китерә, ул һәрвакыт микротубул өзелү белән бергә булмый29.Моннан тыш, уроген кислотасы туемнары кебек, патоген яки элититор тамырның бозылуына китерә.Шулай итеп, оборона җавапларын һәм цитоскелетонны бәйләүче молекуляр белем - чишелергә тиешле кызыклы проблема.Урсон кислотасы белән бәйле аз молекуляр авырлык кушылмаларын, шулай ук төрле куәтле туемнар спектрын кулланып, алар билгесез кәрәзле механизмнарны максат итеп куярга мөмкин.
Бергә тупланып, микротубул динамикасын модульләштерүче яңа кушылмаларны табу һәм куллану үсемлек күзәнәк формасын билгеләү нигезендә катлаулы молекуляр механизмнарны чишү өчен көчле ысуллар бирәчәк.Бу контекстта күптән түгел эшләнгән кушылма урмотон кислотасы, ул микротубулларга һәм актин филаментларына тәэсир итә һәм күзәнәк үлеменә китерә, микротубул контроле һәм бу башка механизмнар арасындагы бәйләнешне ачыкларга мөмкинлек бирә ала.Шулай итеп, урбенон кислотасын кулланып химик һәм биологик анализ үсемлек цитоскелетонын контрольдә тотучы молекуляр көйләү механизмнарын аңларга ярдәм итәчәк.
С. .-сойтон (Термо Фишер Фәнни, Inc.), 0,5% (w / v) кукуруз экстракты (KOGOSTCH Co., Ltd., Япония), 0,2% (w / v) (NH4) 2SO4 һәм 0,2% CaCO3 деонизацияләнгән суда.(стерилизация алдыннан pH 7.4).Орлык культуралары 2 көн дәвамында 27 ° C температурада әйләнүче салгычта (180 әйләнеш) инкубацияләнде.Каты дәүләт ферментациясе аша җитештерү.Орлык культурасы (7 мл) 500 мл К-1 савытка күчерелде, 40 г җитештерү чарасы булган 15 г басылган арпа (MUSO Co., Ltd., Япония) һәм 25 г деонизацияләнгән су (pH көйләнмәгән). стерилизация алдыннан).).Ферментация 30 көн караңгыда 14 көн дәвамында башкарылды.Ферментация материалы 40 мл / шешә EtOH белән алынган һәм центрифуга (1500 г, 4 ° C, 10 мин).Мәдәният супернанты (60 мл) 10% MeOH / EtOAc катнашмасы белән алынган.Органик катлам калдыкны (59,5 мг) алу өчен киметелгән басым астында парга әйләнде, ул кире фаза баганасында (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID) HPLC градиент элитациясе белән (0-10 минут: 90%). 10 мм × озынлыгы 250 мм) H2O / CH3CN, 10–35 минут: 90% H2O / CH3CN - 70% H2O / CH3CN (градиент), 35–45 минут: 90% H2O / EtOH, 45-155 минут: 90% H2O / EtOH - 100% EtOH (градиент (градиент), 155–200 мин: 100% EtOH) 1,5 мл / мин агым тизлегендә, кумамонамид (1, 36,0 мг) ак аморф порошогы итеп изоляцияләнде.
Кумамотоамид (1);1H-NMR (500 МГц, CDCl3) δ 6.93 (т, J = 2,5 Гц, 1Х), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Гц 1Х), 6.05 (т, J = 3,8 Гц, 1Х).), 4.08 (с, 3Х);13C-NMR (125 МГц, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119,9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M + H] +: [C6H9N2O2] + исәпләнгән кыйммәт: 141.0659, үлчәнгән кыйммәт: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 см - 1.
Колумбия орлыклары (Col-0) Arabidopsis биологик ресурс үзәгеннән (ABRC) тикшеренү рөхсәте белән алынган.Кол-0 орлыклары безнең лаборатория шартларында таралдылар һәм сакландылар һәм кыргый типтагы Арабидопс үсемлекләре буларак кулланылды.Арабидопс орлыклары стерилизацияләнде һәм 2% сакроза (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w / v) 2- (4-морфолино) этанезульфон кислотасы (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) ярым көчле Мурашиге һәм Ског уртада стерилизацияләнде һәм культураланды. ).) һәм 1,5% агар (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, 23 ° C һәм даими яктылыкта.Phs1-1 мутанты орлыкларын Т.Хашимото (Нара Фән һәм Технология Институты) биргән.
SR-1 штамм орлыклары Т.Хашимото (Нара Фән һәм Технология Институты) белән тәэмин ителгән һәм кыргый тәмәке үсемлекләре буларак кулланылган.Тәмәке орлыклары стерилизацияләнде һәм үсемлекне күтәрү өчен өч төн стериль суга баттылар, аннары 2% сакароза, 0,05% (w / v) MES, һәм 0,8% геллан сагызы булган Fujifilm Wako Pure Chemical) ярты көчле эремәгә урнаштырылды. Мурашиге.һәм Skoog урта) pH 5.7 белән һәм 23 ° C даими яктылыкта инкубацияләнгән.
Так-1 штаммы Т. Кохчи (Киото Университеты) тарафыннан бирелгән һәм бавыр кортын өйрәнү өчен стандарт эксперименталь берәмлек буларак кулланылган.Gemma стерилизацияләнгән культуралы үсемлекләрдән алынган, аннары Gamborg B5 уртача (Fujifilm Wako Pure Chemical) 1% сакароза һәм 0,3% геллан сагызы булган һәм өзлексез яктылыкта 23 ° C инкубацияләнгән.
Тәмәке BY-2 күзәнәкләре (Nicotiana tabacum L. cv. Якты Сары 2) С. Хасезава (Токио Университеты) белән тәэмин ителгән.BY-2 күзәнәкләре үзгәртелгән Линсмайер һәм Ског уртада 95 тапкыр эретелгән һәм атна саен 2,4-дихлорофеноксицетик кислотасы 32 белән тулыландырылган.Күзәнәкнең асылынуы әйләндергеч салгычта 130 минутта караңгыда 27 ° C ка кушылды.Күзәнәкләрне яңа уртача күләмнән 10 тапкыр юыгыз һәм шул ук шартларда реанимацияләгез.BY-2 трансгеник күзәнәк сызыклары TagRFP-TUA6 микротубул маркерын яки актин филамент маркеры GFP-ABD2 гөлҗимеш мозаик вирусы 35S промоутеры нигезендә ясалган, 33,34,35.Бу күзәнәк сызыклары оригиналь BY-2 күзәнәк линиясе өчен кулланылган процедуралар ярдәмендә сакланырга һәм синхронлаштырылырга мөмкин.
HeLa күзәнәкләре Дулбекконың үзгәртелгән Бөркет урта (DMEM) (Life Technologies) культурасында 10% фетал бовины серумы, 1,2 У / мл пенициллин, һәм 5 ° CO2 белән 37 ° C инкубаторда 1,2 μг / мл стрептомицин белән тулыландырылган.
Бу кулъязмада сурәтләнгән барлык экспериментлар Япониянең биосефетика кагыйдәләре һәм күрсәтмәләре нигезендә башкарылды.
Кушымталар диметил сульфоксидында (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) запас чишелешләре буларак эретелгәннәр һәм Арабидопсис, тәмәке өчен MS уртачада яки бавыр өчен Gamborg B5 уртада эретелгән.Тамыр үсешен тыю анализы өчен, күрсәтелгән кушылмалар яки DMSO булган агар уртага 10дан артык орлык чәчелде.Орлыклар 7 көн үсеш палатасында инкубацияләнде.Орлыклар фотога төшерелгән һәм тамырларның озынлыгы үлчәнгән.Arabidopsis үсемлек анализы өчен, тәлинкәгә 48 орлык 200 μM кушылмасы яки DMSO булган агар уртага чәчелде.Арабидопс орлыклары үсү палатасында үстерелгәннәр һәм чәчелгән үсентеләр саны чәчелгәннән соң 7 көннән саналган.Тәмәке үсүен тикшерү өчен, тәлинкәгә 24 орлык 200 μM KAND яки DMSO булган агарда чәчелде.Тәмәке орлыклары үсү палатасында үстерелде һәм чәчелгән үсентеләр саны 14 көннән соң саналды.Бөернең үсүен тыю анализы өчен, һәр тәлинкәдән 9 яралгы KAND яки DMSO күрсәтелгән концентрацияләрен үз эченә алган агар уртага капланган һәм 14 көн үсеш палатасында инкубацияләнгән.
Тамыр меристемын күз алдына китерү өчен 5 мг / мл пропидий йод (PI) белән буялган үсентеләрне кулланыгыз.PI сигналлары TCS SPE конфокаль лазер сканерлау микроскопы ярдәмендә флюоресенция микроскопиясе белән күзәтелде (Leica Microsystems).
Roots-глюкуронидаз (GUS) белән тамырларның гистохимик буяулары Малами һәм Бенфей36 тасвирлаган протокол нигезендә башкарылды.Орлыклар төнлә 90% ацетонда урнаштырылды, 0,5 мг / мл 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-d-глюкурон кислотасы белән GUS буферында 1 сәгать дәвамында гидратланган хлоральдегид эремәсенә урнаштырылды.(8 г хлорлы гидрат, 2 мл су һәм 1 мл глицерол) һәм Axio Imager M1 микроскопы (Карл Зейс) ярдәмендә дифференциаль интерфейс контраст микроскопиясе белән күзәтелә.
Тамыр почмаклары вертикаль урнаштырылган тәлинкәләрдә үскән 7 көнлек үсентеләрдә үлчәнде.Тамыр почмагын 6-нчы адымда күрсәтелгәнчә тарту векторы юнәлешеннән үлчәгез.
37 протоколга кечкенә үзгәрешләр кертеп, корталь микротубулларның урнашуы сурәтләнгәнчә күзәтелде.Анти-tub-тубулин антителасы (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) һәм Alexa Fluor 488-тычканга каршы IgG (Термо Фишер Фәнни: A32723) 1: 1000 һәм 1: 100 эремәләрдә төп һәм икенчел антителалар буларак кулланылган, тиешенчә.Флуоресцент рәсемнәр TCS SPE конфокаль лазер сканерлау микроскопы ярдәмендә алынган (Leica Microsystems).Z-стакан рәсемнәрен алыгыз һәм җитештерүче күрсәтмәсе буенча максималь интенсивлык проекцияләрен булдырыгыз.
HeLa күзәнәкләрен тарату анализы җитештерүче күрсәтмәсе буенча күзәнәк санау комплекты 8 (Дожиндо) ярдәмендә башкарылды.
E. coli DH5α үсеше 600 нм (OD600) спектропотометр ярдәмендә культураның күзәнәк тыгызлыгын үлчәү белән анализланды.
Трансгеник BY-2 күзәнәкләрендәге циткелет оешмасы CSU-X1 конфокаль сканерлау җайланмасы (Йокогава) һәм sCMOS камерасы (Zyla, Andor Technology) белән җиһазландырылган флуоресцент микроскоп ярдәмендә күзәтелде.Osитоскелет тыгызлыгы рәсем анализы белән бәяләнде, алар цитоплазмик пиксельләр арасында цитоплазмик пиксельләр арасында конфокаль рәсемнәрдә ImageJ программасын кулланып 38,39 сурәтләнгән.
BY-2 күзәнәкләрендә күзәнәк үлемен ачыклау өчен, күзәнәк асылмалы аликот 0,05% Эванс зәңгәр белән бүлмә температурасында 10 минутка инкубацияләнде.Сайланма Эванс үлгән күзәнәкләрнең зәңгәр буяулары буяуны яшерен күзәнәкләрдән плазма мембранасы экструзиясенә бәйле.Агылган күзәнәкләр якты кыр микроскопы ярдәмендә күзәтелде (BX53, Olympus).
HeLa күзәнәкләре DMEMда үскән, 37% C һәм 5% CO2 дымлы инкубаторда 10% FBS белән тулыландырылган.Күзәнәкләр 100 μM KAND 11, кумамонамик кислотасы 6, кумамонамид 1, 100 нг / мл колцемид (Гибко), яки 100 нг / мл Нокодмаз (Сигма) белән 37 сәг.Күзәнәкләр MetOH белән 10 минутка, аннары бүлмә температурасында 5 минутка асетат белән тоташтырылды.Тикшерелгән күзәнәкләр β-тубулин беренчел антитела белән инкубацияләнде (1D4A4, Протеинтех: 66240-1) 0,5% BSA / PBSда 2 сәгать эретелгән, 3 тапкыр TBST белән юылган, аннары Alexa Fluor кәҗә антителасы белән инкубацияләнгән.488 1 сәгать.- Тычкан IgG (Термо Фишер Фәнни: A11001) һәм 15 нг / мл 4 ′, 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) 0,5% BSA / PBSда эретелгән.TBST белән өч тапкыр юылганнан соң, Никон тотылу Ti-E инверсия микроскопында тапланган күзәнәкләр күзәтелде.Рәсемнәр суытылган Хамаматсу ORCA-R2 CCD камерасы белән MetaMorph программа тәэминаты (Молекуляр җайланмалар) ярдәмендә төшерелде.
Пост вакыты: 17-2024 июнь